在硅膠上或雜化基質顆粒上鍵合了如C18、C8、C4或苯基等鍵合相的色譜填料所裝填的色譜柱，按反相色譜條件進行操作和分離。反相是液相色譜中最常使用的分離模式，而C18柱是最常使用的反相色譜柱之一。

新色譜柱的活化與柱效測試

拿到一根新的色譜柱，首先要做的事情是查看色譜柱的說明書，了解色譜柱的基本信息，包括pH值范圍、最高操作溫度、最大操作壓力等信息，再查看色譜柱柱效測試報告，準備柱效測試所用分析物及試劑，然后按以下步驟進行色譜柱活化及柱效測試：

1 液相連接二通，使用新鮮經過濾的水和乙腈或甲醇（根據測試報告中的流動相選擇有機溶劑）沖洗液相系統，確保液相系統干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。

2 將色譜柱入口端連接到液相系統上，柱出口端先不連接檢測器，應直接連到廢液收集器；色譜柱上有箭頭標明正確方向，取用色譜柱時避免磕碰掉落。

3 在0.1ml/min流速下用乙腈（甲醇）或保存溶劑潤洗色譜柱，最少2小時，或按照色譜柱說明書上的方法進行活化。

4 參照柱效測試報告中的方法，更換柱效測試所用流動相，緩慢調節流速至柱效測定流速，平衡色譜柱，至少5-10倍柱體積流動相（例如：250×4.6mm 的色譜柱柱體積為 4.2 ml，以 1 ml/min 流速10倍柱體積需要平衡 42 分鐘），直至壓力和基線穩定。

常見色譜柱柱體積匯總表

5參照柱效測試報告中的方法測試柱效，如果測試結果略低于測試報告，屬于正常情況，如果結果明顯偏低、峰形拖尾，說明所使用的色譜柱或液相系統處于非理想狀態，需要進行排查。

6 記錄測試方法及結果，并作為定期柱效測試的參考值。

色譜柱的使用

1了解色譜柱的使用限度，避免流動相pH、柱溫、柱壓等超過色譜柱的使用上限，縮短色譜柱使用壽命或損壞。

2 流動相必須過濾和脫氣，每過24h-48h就應新配水相流動相，并同時更換或清洗流動相溶劑瓶，以避免流動相長菌。

3 再使用流動相平衡色譜柱之前用5%-10%甲醇（乙腈）沖洗系統及色譜柱，確保系統及色譜柱中沒有緩沖鹽或較高的有機相，避免緩沖鹽遇較高濃度的有機相析出。

4 開始進樣前，用20倍柱體積的起始流動相條件進行平衡；沒有充分老化平衡的色譜柱，將會出現柱效較低、以及保留時間漂移的問題。如果使用梯度條件，每次梯度之間，用8-10倍柱體積的起始流動相條件再次平衡。

5 若使用雙通道在線混合流動相，預先檢查流動相各組分的兼容性，例如磷酸鹽緩沖液與高比例乙腈（≥70%）混用時，可能發生鹽析出。

6 確保樣品不含顆粒性雜質，如果樣品過臟，或有微粒微粒存在，需要更換適合的樣品制備方法，再使用樣品過濾器時確保過濾膜與樣品溶劑不相溶，也可以考慮高速離心方法去除顆粒，例如8000轉數以上離心20分鐘，移取上清液進樣。

7 確保樣品溶液與流動相兼容，進樣后不會發生沉淀，或溶劑不相溶情況。通常使用流動相或比流動相洗脫強度弱的流動相（即有機溶劑比例較低），溶劑或稀釋樣品，這樣可以獲得最好的峰形和檢測靈敏度。

8 每次啟動泵時，應將流速緩慢升高，避免直接從方法規定的流速啟動泵（如從 0.1ml/min啟動泵，每次升幅為0.1ml/min）。

9 分析過程中，每針或間隔數針使用空白溶液清洗柱內可能累積的污染物，分析結束后采用高比例水相除去柱內緩沖鹽，再采用高比例有機相除去柱內的污染物。

10 檢測完成后，建議每8個小時后，將流動相中乙腈的比例升高至 60％沖洗色譜柱45分鐘（此時不需要將含有離子對的緩沖鹽溶液換成水，保持柱溫 45℃或適合的較高溫度）；應對色譜柱進行徹底清洗，先用 10：90 乙腈（或甲醇）：水（體積比）沖洗色譜柱30分鐘（根據緩沖鹽或離子對的濃度調整沖洗時間），然后用高比例乙腈或甲醇沖洗 30-60分鐘。

11 色譜柱保存于高比例有機相中（乙腈或甲醇），如長期不使用色譜柱需將色譜柱保存在說明中要求的保存液中，并定期對色譜柱進行活化，以避免色譜柱中的保護液干涸。

12 在色譜柱使用過程中，定期進行柱效測試，記錄塔板數及壓力，追蹤監控色譜柱的性能變化；如發現色譜柱柱效下降，需進行柱效測試進行確認，再生后再測試柱效以確定再生效果。

13 當使用2.1mm色譜柱時，建議優化系統，以減少譜帶展寬（譜帶擴展體積不得超過20-40μl），包括使用檢測器微量流通池、減少進樣器LOOP環體積、使用較小內經（如0.12mm）的系統管路,并確保色譜柱與管路連接恰當，無死體積。

14 使用小顆粒填料（如2.5μm）短柱進行快速分離時，需要考慮以下因素：

a. 確保管路與色譜柱連接恰當，無死體積，盡量優化系統減少譜帶展寬；

b. 提高采樣頻率至10點/秒以上；

c. 較小粒徑的色譜柱產生的柱壓較高，而較小粒徑要達到最優色譜效率所需的線速度較高，請根據所用LC系統的實際情況調節流速；

d. 可使用較高的柱溫來補償小顆粒造成的壓力升高，例如40℃。

柱清洗與再生

保留時間漂移、壓力升高，色譜柱峰形發生變化如出現嚴重拖尾、肩峰甚至峰分叉，分離度降低，這些都強烈提示色譜柱受到污染。可采用以下步驟處理：

1 如系統接有在線過濾器和保護柱，首先排查在線過濾器與保護柱，進行更新替換。日常操作中，當壓力升高10%或柱效降低10%時，就應該考慮更換在線過濾器或保護柱。

2 使用高比例有機相進行沖洗（請注意避免鹽析出、通常可用梯度升高法，然后維持在高比例甚至100%有機溶劑條件下）。此操作通常可洗去大部分污染物。

3 如有機溶劑清洗不能解決問題，可采用如下方法進行色譜柱清洗和再生。根據樣品性質及你所了解的污染物性質選擇清洗方法，用至少20倍柱體積的HPLC級溶劑清洗色譜柱，將流動相溫度升至35-55℃可提高清洗效率。

注：

1 防止緩沖鹽析出，非極性樣品的沖洗，可以先用高比例異丙醇水沖洗。

2 除非確保您的系統與四氫呋喃和正己烷完全兼容，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無法用反相有機溶劑如乙腈清洗干凈時才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統在四氫呋喃和乙腈中的暴露時間。

4 可以考慮對色譜柱進行倒沖，特別是當問題表現為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時。操作時，將色譜柱倒接，并與檢測器斷開，使用低流速0.2ml/min,進行過夜沖洗，并封堵檢測器入口及出口端以免溶劑揮干產生氣泡。