1. 概述

蛋白濃度測(cè)定常使用BCA法，這是一種比色法測(cè)定，此外，我們也可以直接通過紫外吸收法來測(cè)定蛋白含量。

后者操作更簡(jiǎn)單，不需要顯色，整個(gè)測(cè)定時(shí)間非常短。適合用于對(duì)蛋白含量和純度進(jìn)行粗略判斷的場(chǎng)景，例如SDS-PAGE電泳前大概估算一下蛋白濃度，或者是判斷溶液中是否含有雜質(zhì)污染。

紫外吸收法通過測(cè)量蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸，如色氨酸、酪氨酸，在280nm處的吸光度來定量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)便快速，尤其是樣品測(cè)定后還能回收繼續(xù)用，不會(huì)被檢測(cè)過程消耗掉。

此外，紫外吸收法不受低濃度的鹽干擾，如生化制備中常用來鹽析的硫酸銨及大多數(shù)緩沖液，因此格外適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)橹恍枰赖鞍踪|(zhì)濃度的相對(duì)變化水平，而不需要絕對(duì)定量。

2. 實(shí)驗(yàn)原理

●最常見的方法是直接測(cè)280nm處的吸光度，這是由于酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，在此處有一個(gè)吸收峰，且在各種蛋白質(zhì)中的含量相差不很大。

●此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。肽鍵相關(guān)的吸收峰較多，214nm處也可作為參考。

●核酸在260nm處有一個(gè)最強(qiáng)的吸收峰，可用于校正。

3. 三種紫外吸收法

1. 280nm的光吸收法

此法只測(cè)定280nm一處的吸光度，思路是將待測(cè)樣本配制為溶液在紫外分光光度計(jì)上直接讀取280nm處的吸光度A280，蛋白質(zhì)濃度需控制在0.1~1.0mg/mL內(nèi)。將讀數(shù)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。

如果待測(cè)蛋白較為冷門，查不到已知數(shù)據(jù)，可選用一種酪氨酸和色氨酸含量與待測(cè)蛋白質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以后續(xù)參考計(jì)算。

以下以BSA為例展示一組測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液濃度應(yīng)為1.0 mg/ml。

注意：做標(biāo)準(zhǔn)曲線需要設(shè)置空白對(duì)照組（下表編號(hào)1）；每一組應(yīng)做三次技術(shù)重復(fù)以減弱誤差；比色皿換樣本時(shí)應(yīng)用蒸餾水清洗2~3次以避免上一次檢測(cè)的溶液殘留導(dǎo)致誤差。

此處虛擬一組吸光度數(shù)據(jù)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線：

假設(shè)我們的待測(cè)樣本其吸光度A280做了三次技術(shù)重復(fù)后平均值為0.668，在標(biāo)準(zhǔn)曲線縱軸上找到0.668的位置，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知蛋白質(zhì)濃度在0.334mg/mL附近。

2. 280nm和260nm的吸收差法

核酸的吸收高峰在260nm附近，在260nm處的消光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。此處提供一則廣泛應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)公式：

純蛋白質(zhì)的光吸收比值：A280/A260 = 1.8

純核酸的光吸收比值： A280/A260 = 0.5

含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，由此吸收差值，代入以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度：

蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)=1.45×A280－0.74×A260

此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。我們已將其納入老司機(jī)開發(fā)的計(jì)算器：實(shí)驗(yàn)快算中，只需輸入兩個(gè)讀數(shù)即可計(jì)算。

此處我們虛擬兩個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

A280：0.511

A260：0.803

輸入 蛋白濃度紫外吸收換算 計(jì)算器，獲取結(jié)果：

3. 215nm與225nm的吸收差法

若蛋白質(zhì)濃度低到不能使用280nm的光吸收檢測(cè)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。

與方法一類似，還是使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成20～100 mg/mL的一系列5.0 mL的蛋白質(zhì)溶液，分別測(cè)定其215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算吸收差D：

吸收差D= A215 －A225

以吸收差D為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將未知樣品的吸收差代入曲線，即可查出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。

4. 注意事項(xiàng)

進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此需特別注意待測(cè)樣本溶液的pH值應(yīng)與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線所處的pH值保持一致；

紫外吸收法畢竟是通過吸光度進(jìn)行間接測(cè)量，準(zhǔn)確率較差。如對(duì)精度有較高要求，還需結(jié)合或選擇其它方法；

如果使用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線，若待測(cè)樣本的酪氨酸與色氨酸含量與其所用標(biāo)準(zhǔn)蛋白的差異較大，會(huì)造成一定誤差；

若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾，這一部分雖然可以通過方法2計(jì)算校正，但不能完全抹消誤差。

5. 參考文獻(xiàn)

[1] 張建社，褚武英，陳韜，2009，蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社