活性氧（ROS）是氧代謝的天然副產物，正常情況下，機體含量較低。當機體受到損傷刺激時，如藥物毒性、缺氧等，ROS水平會急劇增加，超過機體自身清除能力時，機體氧化-抗氧化作用失去平衡，從而導致細胞膜破壞，最終引起機體細胞死亡。因此，ROS的測定有助于判斷細胞損傷情況。

 

基本原理：目前檢測細胞內ROS水平常用的是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA可以自由穿過細胞膜，本身沒有熒光。細胞內的酯酶可將DCFH-DA水解生成不能通過細胞膜的DCFH，這樣使得探針在細胞內形成積聚。經過經細胞內ROS的氧化，DCFH可轉變為有熒光的DCF，且熒光的強度與ROS的水平成正比。

 

一、實驗流程

 

以下是流式細胞儀檢測貼壁細胞ROS的實驗步驟及注意事項。

 

實驗步驟：

 

1、準備細胞：將目的細胞均勻鋪至六孔板中，實驗組和對照組分別做相應處理，并預設空白管（即不裝載探針）。至細胞密度達到80%-95%。

 

2、清洗：用PBS將六孔板中細胞分別清洗1-2次，并棄去PBS。

 

3、消化：用胰酶將六孔板中細胞消下來，移至1.5mlEP管中，并做好標記。

 

4、離心：1200r，常溫，離心5min。

 

5、探針配制：按照2μl DCFH-DA原液：3ml無血清培養基配制，上下顛倒混勻（注意避光）。

 

6、加入探針：棄去4中培養基，空白管加入1ml無血清培養基，其余均加入1ml配制好的探針液，并重懸細胞（注意避光）。

 

7、孵育：37°C避光孵育20min。

 

8、離心：1200r，常溫，離心5min，棄去上清。

 

9、清洗：用1ml冷PBS清洗，1200r，常溫，離心5min，棄去上清，重復2次（注意避光）。

 

10、上機：將細胞用500μl冷PBS重懸，并移至流式管，上機。

 

注意事項：

 

1、消化細胞時，以細胞剛好掉落為好，不可時間過長，避免過度消化造成細胞損傷而影響實驗結果。

 

2、探針配置時，一般按照1：1000用無血清培養基稀釋DCFH-DA（終濃度為10Μm），不同的細胞系條件有所不同，需自行摸索。

 

3、加入探針后，一定要充分混懸細胞，以保證探針完全結合。

 

4、探針孵育時，每隔3-5min需顛倒混勻。

 

5、探針孵育時間不同細胞可能會不一樣，一般為20-30min。

 

6、最佳激發波長為488nm，最佳發射波長為525nm。

 

二、結果分析

 

FlowJo 是一款流式細胞數據分析軟件，通過圖像分析細胞的各種變化，利用自帶的分析功能，導出可以二次編輯的圖形。它可以支持多種格式，并且可以做出質量不錯的圖。接下來介紹如何對活性氧（ROS）的流式-單染數據分析。

 

1、導入流式數據（以fcs格式為例）：

 

將要導入的文件（一個或多個）拖入All Samples中。

 

圖 1

 

2、設置橫縱坐標：

 

根據以下箭頭所示位置，將橫軸設置為FSC-A：：FSC-A，縱軸設為SSC-A：：SSC-A。

 

圖 2

 

3、調整細胞群：

 

分別調整以下箭頭所示位置，將絕大部分目的細胞調整至視野中。

 

圖 3

 

選擇Customize Axis，將細胞群調整至中間位置，點擊Apply，橫縱軸操作一樣。

 

圖 4

 

4、圈出主要細胞群：

 

點擊下圖所示位置，點擊設門工具，選取目標細胞。

 

圖 5

 

圈出大多數細胞至90%以上。彈出對話框輸入細胞名稱，點擊OK。

 

圖 6 

 

5、調整橫縱坐標：

 

雙擊圈出的細胞群，就可以直觀看到所圈出的細胞群。 

 

圖 7

 

參考步驟2將橫軸改為FL4-A：：APC-A，縱軸更換為Histogram，即X軸選擇熒光通道，Y軸選擇直方圖。 

 

圖 8

 

6、將門應用到所有細胞：拖動圖8所示的門至上方的All Samples中，即可看到這個門應用到了所有細胞，（如果需要單獨應用，則拖到相應的細胞即可。）雙擊任意一個門，即可看到剛才的直方圖。點擊上方的左右箭頭可以查看其他的樣本。

 

圖 9

 

7、繪制圖形

 

點擊上方的Layout Editor，出現右側涂層框。

 

圖 10

 

將一個門拖入涂層窗口中，這樣會自動做一張信息圖。

 

圖 11

 

將其他的樣本依次拖入這個直方圖中（如果拖動到頁面中就再單獨添加一張圖），就得到一張疊加圖。 

 

圖 12

 

點擊鼠標右鍵，在Histograms中可以選擇直方圖的疊加方式，比較常見的為Offset。

 

圖 13

 

雙擊流式圖，在Specity窗口中點擊Smoothing對曲線進行平滑，會好看很多。

 

圖 14

 

通常我們不需要右側的表格，選中按下Delete進行刪除，至此就得到了一張基本可以發表的流式圖。

 

圖 15

 

8、導出編輯：

 

在Layout的File菜單中，點擊Export Image。如果使用AI，選擇SVG格式；如果使用CorelDraw，使用EMF格式。

 

圖 16

 

參考資料：

 

https://images.app.goo.gl/SAR9CiAzR4xBoCZr8

 

Arfin S, Jha NK, Jha SK, et al. Oxidative Stress in Cancer Cell Metabolism. Antioxidants (Basel). 2021;10(5):642. Published 2021 Apr 22.

 

Rajneesh, Pathak J, Chatterjee A, et al. Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cyanobacteria Using the Oxidant-sensing Probe 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate (DCFH-DA). Bio Protoc. 2017;7(17):e2545. Published 2017 Sep 5.