本研究基于可降解鋅合金良好的材料學(xué)性能，令人滿意的生物相容性以及理想的成骨活性，進一步選擇具備雙相成骨活性元素Sr，設(shè)計制備了可降解Zn-Sr合金體系。在體外評估Zn-Sr合金良好的成骨活性，并嘗試探究了Zn-Sr合金發(fā)揮促成骨活性的作用機制，進一步建立大鼠股骨髁骨缺損模型，于體內(nèi)驗證Zn-Sr合金的骨缺損修復(fù)效果。
01、研究內(nèi)容簡介
盡管骨組織有著較強的再生修復(fù)能力，但由嚴重創(chuàng)傷、惡性腫瘤或先天性疾病引起的骨缺損，尤其是臨界性骨缺損，仍需應(yīng)用骨移植物才能修復(fù)。現(xiàn)階段臨床應(yīng)用的骨修復(fù)材料主要包括骨（自體骨、同種異體骨、異種骨），生物陶瓷類（以HA、β-TCP、CaP為代表），合成聚合物類以及醫(yī)用金屬材料。其中自體骨以其良好的成骨，骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)特性仍被認為是骨修復(fù)材料的金標準，但自體骨移植存在著供區(qū)疼痛不適、供區(qū)繼發(fā)性骨缺損、可用骨量有限，與缺損處形態(tài)不匹配等缺點。而以HA、β-TCP、CaP為代表的生物陶瓷，彈性模量常高于骨組織但力學(xué)性能差，并且降解行為不可控；合成材料主要包括PLA, PCL,PGA,PLGA，其主要缺點是骨傳導(dǎo)特性的缺失以及遠低于皮質(zhì)骨的力學(xué)強度和彈性模量，此外，合成聚合物材料降解產(chǎn)物多呈弱酸性，易引起局部炎癥反應(yīng)不利于骨修復(fù)。傳統(tǒng)醫(yī)用金屬材料（如鈦、不銹鋼等）具備良好的力學(xué)強度，但這些惰性金屬往往具有著遠高于皮質(zhì)骨的彈性模量，可以造成應(yīng)力遮擋、骨量丟失等等；更重要的，這些金屬材料欠缺足夠的成骨活性，往往只能被用作支撐用途。
總的來說，目前的骨替代材料要么力學(xué)性能較差，如自體骨，生物陶瓷以及聚合物等，要么力學(xué)性能足夠但欠缺成骨活性，如鈦合金，不銹鋼等。因此，一種具備良好成骨活性的可降解金屬材料有望解決目前骨修復(fù)材料領(lǐng)域的困局。因此，在本研究中，我們基于可降解鋅合金良好的成骨活性，進一步添加了具備雙相成骨活性的合金元素Sr，制備了可降解Zn-Sr合金體系，于體外、體內(nèi)系統(tǒng)評估其成骨活性，探究其發(fā)揮成骨功能的機制，為骨缺損修復(fù)尤其是臨界性骨缺損及承重部位骨缺損提供一種極富前景的新選擇。
在本研究中，不同質(zhì)量分數(shù)（0%，0.1%，0.4%，0.8%）的Sr被加入純Zn中，按不同質(zhì)量分數(shù)制備為純Zn，Zn-0.1Sr合金，Zn-0.4Sr合金和Zn-0.8Sr合金。系統(tǒng)檢測其材料表征后，首先我們對鋅合金的細胞相容性表現(xiàn)進行了評估。我們選擇CCK-8法，Live/Dead染色及細胞骨架染色評估與Zn-Sr合金浸提液共培養(yǎng)后MC3T3-E1細胞的增殖活性及細胞形態(tài)，結(jié)果如Figure 1所示。與純Zn相比，Sr元素的加入有效改善了Zn-Sr合金的細胞相容性表現(xiàn)。
Figure 1. In vitro cytocompatibility of Zn-Sr alloys. (a) MC3T3-E1 cell activity after co-culturing for 1, 3, 5 and 7 days in pure Zn and Zn-Sr alloy extracts (one- and two-fold dilutions; mean ± standard deviation * p < 0.05; ** p < 0.01). (b) Live/dead cell staining and cytoskeletal staining of MC3T3-E1 cells cultured with pure Zn and Zn–Sr alloy extracts (one-fold dilution). Live cells were stained with green fluorescence while dead cells were stained with red fluorescence, while actin filaments were stained with phalloidin (red) and cell nuclei with DAPI (blue).
為了評估Zn-Sr合金的體外成骨活性表現(xiàn)，我們通過堿性磷酸酶活性染色、定量檢測，成骨相關(guān)基因和蛋白（ALP, Col I, OCN, Runx-2）表達水平的檢測，證實了Zn-Sr合金體外可有效促進MC3T3-E1成骨分化，具備良好的成骨活性。接下來，為了探究Zn-Sr合金發(fā)揮促成骨活性的作用機制，我們選擇了Zn-0.8Sr合金，以2倍稀釋的Zn-0.8Sr合金浸提液制備成骨分化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)MC3T3-E1細胞成骨分化，12天后，收集細胞提取總RNA后行mRNA轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果如Figure2所示。可以看到Zn-0.8Sr合金浸提液可通過促進骨的礦化，新生，骨化以及重塑，發(fā)揮成骨活性。進一步的，依據(jù)測序結(jié)果以及western-blot驗證，我們發(fā)現(xiàn)Zn-0.8Sr合金可通過PI3K/Akt, MAPK/Erk 以及 Wnt/β-catenin通路發(fā)揮促成骨活性。
Figure 2. RNA-sequencing and western-blot results of MC3T3-E1 cells cultured for 12 days in an Zn-0.8Sr alloy extract based osteogenic medium (two-fold dilution) and blank osteogenic medium. (a) Gene expression difference. (b) Main biological functions of the up-regulated genes. (c) Quantitative validation of gene expression related to bone mineralization, bone morphogenesis, ossification and bone remodeling regulation, given as mean ± standard deviation. (*p < 0.05; ** p < 0.01). (d) Expression profile and (e) quantitative evaluation of key proteins in the PI3K/Akt, MAPK/Erk and Wnt/β-catenin signaling pathways.
為了評估Zn-Sr合金體內(nèi)促成骨活性表現(xiàn)，我們建立了大鼠股骨髁骨缺損模型，以Zn-0.8Sr合金制備多孔支架修復(fù)骨缺損，選擇純Ti為對照組。植入大鼠體內(nèi)后，于術(shù)后4周，8周，12周分別處死大鼠取材，評估大鼠股骨髁骨缺損修復(fù)情況。Micro-CT檢測結(jié)果如Figure 3所示。由Figure 3可見純Ti支架以及Zn-0.8Sr合金多孔支架的植入位置，新生骨情況以及Zn-0.8Sr合金支架體內(nèi)降解情況。總的來說，隨著時間的推移，新生骨量逐漸增加，且同一時間點時，Zn-0.8Sr合金支架周圍新生骨量顯著大于純Ti支架。同時，Zn-0.8Sr合金支架逐漸降解，周圍降解產(chǎn)物逐漸增加，支架體積逐漸減小。上述結(jié)果證明了Zn-0.8Sr合金體內(nèi)良好的成骨特性。
Figure 3. Micro-CT results of in vivo bone defect repair. (a) Three-dimensional, sagittal, coronal, new bone and implants reconstruction micro-CT images. (b) Quantitative analyses of the osteogenesis indices, including BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Sp, and Tb.Th at indicate times.
完成Micro-CT掃描后，我們對大鼠股骨標本行硬組織切片染色，評價骨缺損修復(fù)情況以及局部炎癥反應(yīng)情況。結(jié)果如Figure 4所示。從Figure 4a，b，c可以看出，隨著時間的推移，Zn-0.8Sr合金支架組新生骨逐漸增多，且較純Ti對照組更多，同時， Zn-0.8Sr合金支架逐漸降解，這證實了Zn-0.8Sr合金良好的骨缺損修復(fù)效果，從Paragon染色（Figure 4d）中也可發(fā)現(xiàn)，Zn-0.8Sr合金組支架周圍未見明顯炎癥反應(yīng)，這提示了Zn-0.8Sr合金良好的局部相容性。
Figure 4. Histological analysis results. Full-view images of the bone defect areas (20×), lower magnification images (50×) and higher magnification images (100×) are arranged from left to right. (a) The Van Gieson staining results of specimens, where each row gives full-view images of bone defect areas (20×), lower magnification images (50×) and higher magnification images (100×). (b) Bone volume fraction (BV/TV) of the both pure Ti and Zn-0.8Sr alloy groups. (c) Toluidine blue staining of the pure Ti and the Zn-0.8Sr alloy groups, where the biodegradable products of the Zn-0.8Sr alloy scaffold were observed 12 weeks after surgery (red arrows). (d) Paragon staining of the pure Ti and the Zn-0.8Sr alloy groups, where desirable bone ingrowth (red arrows), normal bone tissue morphology, regenerative bone, cartilage and fat tissue (yellow arrows) were observed.
本研究設(shè)計制備了可降解Zn-Sr合金體系，并系統(tǒng)研究了Zn-Sr合金的材料性能，體內(nèi)外生物相容性以及生物活性。證實了Zn-Sr合金良好的生物相容性，于體外闡釋了Zn-Sr合金的促成骨活性并探究了其作用機制，并進一步于體內(nèi)驗證了Zn-0.8Sr合金支架修復(fù)骨缺損的效果。Zn-Sr合金以其理想的力學(xué)性能，適宜的降解速率，良好的生物相容性以及生物活性，有望成為骨修復(fù)材料的一種全新選擇，尤其適用于臨界性大段骨缺損或承重部位骨缺損的修復(fù)。
02、通訊作者簡介
第一作者賈博博士
上海市第一人民醫(yī)院住院醫(yī)師，博士。研究方向為骨關(guān)節(jié)相關(guān)感染及并發(fā)癥的診治、可降解金屬基礎(chǔ)與臨床轉(zhuǎn)化研究。
通訊作者戴尅戎院士
中國工程院院士，法國國家醫(yī)學(xué)科學(xué)院外籍通信院士。先后擔任上海第二醫(yī)科大學(xué)（現(xiàn)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院）附屬第九人民醫(yī)院終身教授、骨科主任、院長，現(xiàn)任上海市創(chuàng)傷骨科與骨關(guān)節(jié)疾病臨床醫(yī)學(xué)中心首席科學(xué)家、數(shù)字醫(yī)學(xué)臨床轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心主任、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)3D打印創(chuàng)新研究中心主任、上海交通大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院干細胞與再生醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化基地主任。戴院士曾先后擔任世界華裔骨科學(xué)會會長、亞洲太平洋人工關(guān)節(jié)學(xué)會秘書長、會長、國際內(nèi)固定學(xué)會理事及中國分會主席、國際多學(xué)科生物材料學(xué)會副主席、中華骨科學(xué)會副主任委員、上海骨科學(xué)會主任委員、中國醫(yī)療器械行業(yè)協(xié)會3D打印醫(yī)療器械專業(yè)委員會理會長兼團體標準化技術(shù)委員會主任委員、上海康復(fù)醫(yī)學(xué)工程研究會理事長等30余個國際、國內(nèi)學(xué)術(shù)團體的領(lǐng)導(dǎo)職務(wù)。并先后任醫(yī)用生物力學(xué)、中華骨科雜志、中華外科雜志、中華創(chuàng)傷雜志英文版、臨床骨科雜志、中國骨質(zhì)疏松雜志、中國關(guān)節(jié)外科雜志、Journal of Orthopaedic Surgery、Journal of Orthopaedic Translation等34本雜志的主編、副主編、編委、顧問。發(fā)表論文500余篇，主編、參編專著59本。先后培養(yǎng)碩士29名、博士79名、博士后12名。戴尅戎院士先后獲國家發(fā)明二等獎、國家科技進步獎二、三等獎和部、市級一、二、三等獎46項。并曾榮獲首屆上海市發(fā)明家、“97”香港杰出中國訪問學(xué)人、上海市醫(yī)學(xué)榮譽獎、何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)獎、上海市科技功臣、吳階平醫(yī)學(xué)獎、上海醫(yī)學(xué)發(fā)展終身成就獎等榮譽稱號。2002年經(jīng)法國外交部與衛(wèi)生部批準，被授予地中海大學(xué)榮譽博士稱號，是獲得該殊榮的首位亞洲人。
共同通訊作者鄭玉峰教授
北京大學(xué)工學(xué)院材料科學(xué)與工程系教授、博士生導(dǎo)師，教育部長江學(xué)者特聘教授（2016），科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才（2017），中組部萬人計劃入選者（2019），美國醫(yī)學(xué)與生物工程研究院(AIBME) Fellow（2019）。學(xué)術(shù)研究方向為新型生物醫(yī)用金屬材料與器械。作為項目負責人主持十三五國家重點研發(fā)計劃、國家杰出青年科學(xué)基金（2012）、國家自然科學(xué)基金重點項目等40 余項，出版英文專著2本，中文專著6本，發(fā)表英文SCI論文500余篇，被引用18500余次，H-index為71，獲授權(quán)發(fā)明專利30余項。社會兼職包括Bioactive Materials主編、Materials Letters編輯、Journal of Materials Science & Technology副主編、中國生物材料學(xué)會醫(yī)用金屬分會主任委員、中國生物材料學(xué)會青年委員會主任委員等。
03、資助信息
該研究得到了國家自然科學(xué)基金（51931001）項目的支持。
04、原文信息
Jia Bo#, Yang Hongtao#, Zhang Zechuan#, Qu Xinhua, Jia Xiufeng, Wu Qiang, Han Yu, Zheng Yufeng*, Dai Kerong*;
Biodegradable Zn–Sr alloy for bone regeneration in rat femoral condyle defect model: In vitro and in vivo studies,
Bioactive Materials, 6 (2021) 1588-1604.
