由于不銹鋼植入物的細(xì)胞相容性和機(jī)械抗性，它們是骨替代物的合適候選物，但是它們?nèi)狈ι锘钚圆⑶乙子诩?xì)菌感染。因此，為了克服這些限制，在這項(xiàng)研究中，我們通過電泳沉積(EPD)開發(fā)了一種創(chuàng)新的表面涂層，由(1)玉米蛋白 (2)生物活性玻璃和(3)含銅的生物活性玻璃，一種抗菌和促進(jìn)血管生成的材料制成。

01、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

骨科植入物的骨整合通過不同的步驟進(jìn)行，從最初與體液的相互作用和現(xiàn)場(chǎng)炎癥開始，然后是細(xì)胞層的形成和表面骨的最初產(chǎn)生及其隨后的重塑。因此，在錨固的第一階段，有必要在相鄰骨組織和植入物表面之間建立牢固的連接。此外，將矯形植入物放置在人體的骨部位，例如骨折固定或關(guān)節(jié)置換，通常伴隨著細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)橛欣诠窍嚓P(guān)細(xì)胞代謝的生理環(huán)境也有利于微生物的粘附，就會(huì)導(dǎo)致植入物失敗。

為了避免細(xì)菌附著和植入物的表面定居，并促進(jìn)宿主組織的整合，添加含有抗菌物質(zhì)的生物活性材料正受到越來越多的關(guān)注天然和合成聚合材料都被廣泛用作藥物輸送平臺(tái)，通過提供抗菌劑的調(diào)節(jié)負(fù)載和各種釋放特性，如靶向離子釋放、pH值變化或熱反應(yīng)能力。然而，在附近的骨組織和植入物表面之間獲得牢固的結(jié)合是至關(guān)重要的，這可以通過用生物活性材料如生物活性玻璃或羥基磷灰石涂覆金屬表面來實(shí)現(xiàn)。

為了配制用于骨植入物的抗菌和促再生表面，生物活性離子和聚合物在一個(gè)涂層系統(tǒng)中的組合正在被越來越多地研究。為此，銅(銅)是一個(gè)非常有趣的候選物，因?yàn)樗驯蛔C明對(duì)血管生成有影響，并且是一種強(qiáng)抗菌劑。研究表明，當(dāng)人內(nèi)皮細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)行血管生成時(shí)，銅在內(nèi)皮細(xì)胞中有顯著的分布。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，銅與FGF-2生長(zhǎng)因子結(jié)合，刺激體外血管生成。還證明了銅促進(jìn)人內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞向骨髓譜系的分化增強(qiáng)。在醫(yī)療保健環(huán)境中使用銅作為抗菌材料一直是人們非常感興趣的話題，因?yàn)樽罱脑S多研究都涉及到銅的“接觸殺滅”效應(yīng)的技術(shù)方面。據(jù)觀察，長(zhǎng)時(shí)間孵育后與銅表面接觸的活生物體不會(huì)恢復(fù)，因?yàn)榻佑|銅的影響以大約每小時(shí)7或8個(gè)對(duì)數(shù)的速度發(fā)生。

金屬合金除了在機(jī)械強(qiáng)度和硬度方面的優(yōu)點(diǎn)外，還有一些缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)主要與缺乏生物活性導(dǎo)致的表面腐蝕和纖維組織包裹時(shí)潛在的離子釋放到人體內(nèi)有關(guān)，這降低了植入物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性[1]。不銹鋼316 L可被認(rèn)為是一種適合生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的材料，顯示出適當(dāng)?shù)纳锵嗳菪院团c其他參考金屬相比在機(jī)械性能和較低成本方面的一些優(yōu)勢(shì)。然而，盡管有這些積極的方面，不銹鋼在與周圍組織的生物整合方面顯示出一些缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)可以通過應(yīng)用提供前整合特性的適當(dāng)涂層來克服。

蛋白玉米醇溶蛋白是一種獨(dú)特而復(fù)雜的天然生物聚合物；它屬于醇溶性蛋白質(zhì)，是玉米蛋白質(zhì)的主要儲(chǔ)存來源。玉米醇溶蛋白具有生物可降解性和生物粘附性，并具有特殊的氨基酸，如亮氨酸，可調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)代謝和脯氨酸，對(duì)破骨細(xì)胞的功能和活性具有積極作用，使玉米醇溶蛋白在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。

基于這些前提，在這項(xiàng)工作中，結(jié)合生物活性玻璃和銅摻雜BG的玉米醇溶蛋白復(fù)合涂層采用電泳沉積法進(jìn)行了開發(fā)，并根據(jù)我們之前對(duì)此類涂層的研究進(jìn)行了進(jìn)一步表征。在PBS中進(jìn)行的降解研究、使用不同細(xì)胞的細(xì)胞生存力研究、抗菌活性、抗感染保護(hù)功效和小鼠模型中的體內(nèi)研究首次調(diào)查了復(fù)合涂層在相關(guān)環(huán)境中的性能，從而對(duì)涂層的促再生和抗菌性能進(jìn)行了評(píng)估。

當(dāng)使用10 V的電壓和5分鐘的沉積時(shí)間時(shí)獲得的電泳涂層顯示在圖1中。可以觀察到，用10 V和5分鐘沉積時(shí)間產(chǎn)生的涂層是多孔的、相當(dāng)均勻的并且沒有裂紋，即使表現(xiàn)出不同的表面形態(tài)。可以確定，玉米蛋白和玉米蛋白/CuBG涂層存在相互連接的孔，并且在整個(gè)涂層結(jié)構(gòu)上分布。孔隙率似乎是由水水解形成的，并且考慮到玉米醇溶蛋白分子可以捕獲在沉積過程中從電極底部移動(dòng)到表面的氣泡。當(dāng)涂層內(nèi)部的水蒸發(fā)(以及甘油)并形成多孔結(jié)構(gòu)時(shí)，這種效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致孔的形成。在掃描電鏡圖像中未檢測(cè)到立方氮化硼顆粒的存在。這表明顆粒通過涂層的厚度嵌入生物聚合物基質(zhì)中。這種多孔結(jié)構(gòu)的另一個(gè)原因可能是由CuBG顆粒之間的空間引起的。在玉米蛋白/血糖涂層的情況下，可以觀察到表面的“第一層”顯示一些玉米醇溶蛋白微球和孔隙，似乎是由水水解形成的。樹枝狀結(jié)構(gòu)似乎由不同形狀的玉米醇溶蛋白連接和形成，即細(xì)長(zhǎng)的管和微球。通過直接目視檢查未檢測(cè)到BG顆粒。這種結(jié)構(gòu)的形成可以分為兩個(gè)不同的步驟。首先，圍繞電極的玉米醇溶蛋白分子被沉積并形成第一層。這個(gè)過程之后是BG顆粒與玉米蛋白分子的結(jié)合，這可以導(dǎo)致不同的形狀。那么就有可能是BG顆粒嵌入了這個(gè)被玉米蛋白覆蓋的蠕蟲狀結(jié)構(gòu)中。

圖1。在10 V和5分鐘沉積時(shí)間下，由EPD獲得的玉米醇溶蛋白(a，d)、玉米醇溶蛋白/BG (b，e)和玉米醇溶蛋白/CuBG (c，f)涂層的涂覆電極的光學(xué)顯微鏡圖像(上圖)和SEM顯微照片(下圖)。

圖2中報(bào)告了分別通過污染與金黃色葡萄球菌(圖2a)、大腸桿菌(圖2b)和表皮葡萄球菌(圖2c)直接接觸的涂層的抗菌活性的結(jié)果。玉米醇溶蛋白被認(rèn)為是對(duì)照，假設(shè)在生物膜-浮游分離階段后，由于缺乏抗菌性能，附著在這種表面上的細(xì)菌數(shù)量最高。正如預(yù)期的那樣，玉米蛋白和玉米蛋白/BG涂層在每個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)都沒有顯示出細(xì)菌代謝的減少。另一方面，與玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG涂層相比，銅(玉米醇溶蛋白/ CuBG)的引入導(dǎo)致粘附細(xì)菌細(xì)胞的生存能力急劇下降。用金黃色葡萄球菌獲得的結(jié)果(圖2a)證實(shí)了銅的功效。即使在24小時(shí)時(shí)效果不明顯，但在隨后的幾天中觀察到生物膜活性下降。對(duì)于表皮葡萄球菌生物膜，效果不太明顯(圖2c)。這里，與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌獲得的結(jié)果不同，24小時(shí)后僅觀察到生物膜活性的少量降低。此外，在隨后的幾天中沒有觀察到明顯的生物膜降低，因此表明即使在連續(xù)處理中也存在一定的菌株抗性。然而，F(xiàn)ESEM圖像顯示生物膜聚集體形成的差異，因?yàn)樵阢~摻雜的表面，與玉米蛋白/BG涂層相比，密集簇的存在似乎減少了。具體而言，大腸桿菌(圖2b)顯示了玉米蛋白和玉米蛋白/BG的類似結(jié)果；雖然當(dāng)引入銅時(shí)，在24小時(shí)后檢測(cè)到生物膜活性的顯著降低。此外，在48和78小時(shí)后，生物膜的厚度降低，因此表明銅離子的釋放隨著時(shí)間的推移繼續(xù)抑制生物膜的形成。最后，72小時(shí)生物膜的代表性掃描電鏡圖像證實(shí)玉米蛋白/CuBG表面缺乏生物膜生物量(圖2d)。

圖2。抗菌活性結(jié)果。將銅引入生物活性玻璃(玉米醇溶蛋白/CuBG)與玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG相比，細(xì)菌生存力顯著降低(a-b-c，p < 0.05，用*表示)。掃描電鏡圖像顯示玉米蛋白/CuBG涂層上缺乏明顯的生物膜聚集體。比例尺= 10 μm。

在證實(shí)涂層支持細(xì)胞增殖和抑制細(xì)菌感染的能力后，研究了誘導(dǎo)成骨的可能性。在涂層配方假說中，生物活性玻璃的使用是為了達(dá)到這個(gè)目的，因?yàn)楸娝苤捎谄浠瘜W(xué)組成和固有的生物活性，BGs是最有利于骨樣基質(zhì)形成的無機(jī)材料之一。事實(shí)上，一般來說，當(dāng)血糖被引入生理環(huán)境時(shí)，鈉離子和鈣離子被釋放出來，在表面形成水合硅膠。然后，羥基碳酸磷灰石(HCA)通過不斷摻入Ca2+、PO4 3、、和CO3 2而在表面結(jié)晶。在這項(xiàng)研究中，從生物學(xué)的角度研究了hFOB細(xì)胞在表面培養(yǎng)后的成骨作用。結(jié)果如圖3所示。不出所料，與純玉米醇溶蛋白涂層相比，玉米醇溶蛋白(玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白涂層)的存在加速了細(xì)胞分化；玉米醇溶蛋白/大豆球蛋白和玉米醇溶蛋白/大豆球蛋白涂層在7天和10天后在培養(yǎng)基中的堿性磷酸酶釋放為與純玉米醇溶蛋白涂層相比顯著更高(p < 0.05，用*表示)，因此證實(shí)了BG促成骨刺激。然而，玉米醇溶蛋白單獨(dú)支持成骨也是成功的，因?yàn)?5天后所有值都是可比較的，表明細(xì)胞成熟相似。作為證實(shí)，15天細(xì)胞培養(yǎng)后的基因表達(dá)代表顯示接種到所有測(cè)試涂層上的細(xì)胞表達(dá)相似水平的成骨基因ⅰ膠原(COL 1，圖3b)、骨橋蛋白(OPN，圖3c)和堿性磷酸酶(ALP，圖3d)。成骨基因表達(dá)缺乏顯著差異表明，所用濃度范圍內(nèi)的銅不會(huì)干擾干細(xì)胞分化。這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)橐郧暗墓ぷ鞅砻鳎尫诺慕饘匐x子可能是細(xì)胞分化的負(fù)面因素。

圖3。成骨結(jié)果。與玉米蛋白涂層(a，p < 0.05，用*表示)相比，生物活性玻璃(玉米蛋白/BG和玉米蛋白/CuBG)的存在提高了第7天和第10天堿性磷酸酶的釋放。21天后，成骨基因ⅰ型膠原(COL 1，b)、骨橋蛋白(OPN，c)和堿性磷酸酶(ALP，d)在所有測(cè)試的涂層中表達(dá)相似，表明細(xì)胞成熟相似。

玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白/BG或玉米醇溶蛋白/CuBG涂層通過三元乙丙橡膠方法成功應(yīng)用于不銹鋼基底，證實(shí)了這種處理在金屬表面引入生物活性元素的適用性。該涂層耐機(jī)械損傷，并且在長(zhǎng)時(shí)間浸泡在生理?xiàng)l件下后，在視覺上表現(xiàn)為降解不良。BG和抗菌銅的存在賦予了塊體材料骨傳導(dǎo)和抗感染性能，從而克服了金屬的生物活性差的問題。特別是，在生物活性玻璃中加入銅與玉米醇溶蛋白，成功地顯著降低了涂層受關(guān)節(jié)病原體的感染，而不影響標(biāo)本的細(xì)胞相容性。此外，銅引入了促血管生成特性，并且它不影響B(tài)G體外促成骨活性。所有這些發(fā)現(xiàn)使玉米蛋白/CuBG涂層成為一個(gè)非常有前途的系統(tǒng)，以改善生物惰性可植入金屬材料的抗菌和促骨整合性能。

02、通訊作者簡(jiǎn)介

Laura Ramos Rivera

Institute of Biomaterials, Department of Materials Science and Engineering, University of Erlangen–Nuremberg .

Lia Rimondini

Department of Health Sciences, Universit` a del Piemonte UPO.

Aldo R. Boccaccini

Institute of Biomaterials, Department of Materials Science and Engineering, University of Erlangen–Nuremberg.

03、資助信息

本研究得到德國(guó)學(xué)術(shù)交流服務(wù)(DAAD)(德國(guó))的獎(jiǎng)學(xué)金和哥倫比亞大學(xué)(哥倫比亞)的資助。

04、原文信息

L.R. Rivera, A. Cochis, S. Biser, E. Canciani, S. Ferraris, L. Rimondini, A.R. Boccaccini, 

Antibacterial, pro-angiogenic and pro-osteointegrative zein-bioactive glass/copper based coatings for implantable stainless steel aimed at bone healing, 

Bioactive materials 6(5) (2021) 1479-1490.

Doi: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2020.11.001