【導讀】在教科書和文獻上常常用到檢出限這個概念，但說法五花八門，如，最常見到有：檢出限、檢測限、最低檢出限、最低檢測濃度、定量限、定量下限、最低定量濃度、測定限、儀器檢出限、方法檢出限、樣品檢出限等，聽起來云里霧里，容易被混淆，有必要進行一個梳理。這里最主要的是兩個概念，目前已經基本達成共識：檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。

1 基本概念

     檢測限和定量限是分析方法的重要屬性，在中國藥典2020年版分析方法驗證指導原則中規定這2項是重要的驗證指標，包括定量、限度的雜質測定需要著重考慮檢測限和定量限，且在該版本指導原則中刪除了校正因子以及其中定量限的規定。本文試圖從定義、測量方法、問題和解決方案進行簡單的討論，為分析方法驗證活動中檢測限和定量限的的開展提供一定的參考。 

檢測限（limit of detection，LOD）

     指試樣中被測物能被檢測出的最低量或最低濃度，也叫檢出限。能以適當的置信度被檢出的組分的最小量或最小濃度，檢測限是我們判斷被分析物是否存在的含量水平即有無的判斷。

定量限（limit of quantification，LOQ）

     指試樣中被測物能被定量測定的最低量或最低濃度，其測定結果應具有一定的準確度。定量限體現了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。

2  測定方法
     檢測限和定量限的測量方法有直觀法、信噪比法、基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法等3種方法，不同方法應用范圍有所不同：
   （1）直觀法主要用于非儀器方法，通過目視法觀察逐級稀釋進樣獲得非儀器方法檢出限（或定量測定）的最低濃度或量。
   （2）信噪比法適用于能顯示基線噪音的儀器分析方法，是通過已知低濃度的被測物的檢測信號與基線噪音比較，確定可被檢測出的最小量或濃度。檢測限一般以信噪比為3:1或2:1；定量限一般以信噪比為10:1。
   （3）基于響應值標準偏差和標準曲線斜率法可采用已知標準物質與空白樣品，或已知含量的樣品在低濃度范圍按照分析步驟進行測量，通過分析相當數量的樣品（需要12~20份）計算方法的檢出限和定量測定最低濃度或量，其計算公式為（公式1）：LOD（LOQ）=3.3（或10）δ/S  
     式中：LOD（LOQ）：檢測限（定量限）；δ：響應值的偏差；S：標準曲線的斜率。δ可以通過下列方法測得：（1）測定空白值的標準偏差；（2）標準曲線的剩余標準偏差或是截距的標準偏差來代替。

      ICH于1996年在分析方法驗證指導原則中規定了基于響應值的標準偏差和標準曲線斜率計算檢測限與定量限的方法，隨后USP與EP均收錄了該方法，《中國藥典》2015年版通則9101中首次收錄了該方法，按照LOD=3.3δ/S(LOQ=10δ/S)公式計算，其中δ為響應值的偏差，S為標準曲線的斜率，較為簡便的方法是采用對照品或已知含量的樣品在低濃度范圍內制備系列濃度的線性溶液，按分析步驟進行測量，繪制濃度-峰面積線性回歸曲線計算檢測限與定量限，以某品種為例，見表1。

表1  基于響應值的標準偏差和標準曲線斜率計算檢測限與定量限示例

     通常是在同一張色譜圖中，選取比較平滑的一段基線計算噪音水平，如此，可能因為基線選取段的不一樣導致檢測限(定量限)產生較大差異，可采用隨行空白的方法進行信噪比的計算。《中國藥典》2015年版通則9101明確應把已知低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，以目標峰出峰時間附近空白色譜圖中的噪音進行計算。

3 檢測限和定量限的常見問題

      由于使用上的方便性，信噪比法是目前方法驗證中最常用的測量方法。但信噪比受檢測儀器狀態的影響很大，且與耗材、試劑、樣品前處理等多種因素相關，按信噪比3/10計算與驗證過的檢測限/定量限在下一次檢測時并不是方法的檢測限/定量限，因此導致方法驗證出現異常，測量的定量限（檢測限）并不是真正的方法定量限，特別是定量限可能不能滿足精密度和準確度要求，即定量限測不準原理。

     信噪比法測量檢測限和定量限的主要問題在于其本質上也是一種直觀測量的方法，主要用于儀器檢出限的測量和判斷。而儀器檢出限（對于復雜的系統更應該稱為系統檢出限）則受到由整個檢測系統性能的影響（如高效液相法由HPLC儀器、色譜柱、流動相、檢測器共同組成），其是一個動態的結果。當一臺經確認的儀器（完成安裝確認IQ、設計確認DQ、運行確認OQ）在分析實驗室運行后，其性能必須經過定期的性能確認PQ，或者按計量規程進行校準，確定其整機性能如儀器檢出限等符合性能標準。如在JJG 705-2014液相色譜儀檢定規程中，其最小檢測濃度即儀器檢出限的方法即信噪比法，通過進樣低濃度的標準溶液，再根據標準溶液峰高和基線噪音峰高的比值計算。

     由此可知，信噪比法反映出的是方法驗證當時狀態下系統檢出限/定量限，而非對于方法的檢測限/定量限，在實際使用不能盲從于信噪比3/10的結果。如作者以前在進行一個工藝相關雜質檢測HPLC分析方法驗證時，根據信噪比法計算的檢測限位1μg/ml、定量限為3μg/ml（驗證中S/N均大于10、均值在15左右），因此制定方法的標曲下限為5μg/ml，但在色譜柱使用幾個批次之后，發現標曲下限5μg/ml的S/N就已經掉到10以下了，此時原檢測限的S/N肯定也有著很大的變化，完全沒有達到方法驗證中檢測限、定量限驗證的目的。

4 檢測限和定量限的解決方案

    因為檢測限和定量限常用測量方法的局限性，因此我們并不需要限定信噪比=3或10，而只需要驗證方法的靈敏度符合要求。如通常檢測限應低于限度的1/30，定量限應低于限度的1/10，但當達不到該要求時，只要規定定量限比ICH規定的雜質報告限低即可（如50%報告限）。

    按照檢測限和定量限的常用測量方法如信噪比法的結果并不準確，其僅能反映在當前條件下的儀器（系統）檢出/定量限。因此在分析方法驗證中，不能簡單地以信噪比3/10進行判定和驗證測限和定量限，而應該根據標準限度和相關法律法規，綜合考慮分析方法的靈敏度要求，并可以在分析方法標準操作規程SOP中規定靈敏度溶液的信噪比作為檢測有效的系統適用性標準。