最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）是常常被用于衡量抗菌藥物的研發和藥敏試驗的重要指標。通常地最小抑菌濃度（MIC）是指抗菌藥物抑制細菌生長的最低藥物濃度；最小殺菌濃度（MBC）是指抗菌藥物殺死99%以上細菌的最低藥物濃度。

而對于這兩種濃度，通常是先測定最小抑菌濃度（MIC），然后基于MIC結果測定最小殺菌濃度（MBC）。下面是分享測定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的主要實驗步驟和注意事項：

2.實驗步驟

2.1 準備工作

（1）培養基準備：Middle Brook 7H9肉湯培養基（分枝桿菌）、Middle brook 7H10固體培養基、蒸餾水等

（2）試劑、耗材準備：96孔板、細菌培養皿、試管、錐形瓶、接種環、酒精燈、打火機、高壓蒸汽滅菌鍋、37℃恒溫培養箱、生物安全柜、超凈工作臺、恒溫搖床、移液槍、10/200/1000μL tip頭、酒精或DMSO、麥氏比濁管、0.22μm過濾器等

（3）菌液制備：配置Middle Brook 7H9肉湯培養基、Middle brook 7H10固體培養基使用高壓蒸汽滅菌法121℃、30min進行滅菌處理。

2.2 實驗步驟

（1）將準備的細菌培養皿、試管、錐形瓶、接種環、酒精燈等物品放置在超凈工作臺打開紫外線照射至少30min。

（2）取涂布的平板或是保存在-80℃的菌種在倒好平板上劃線，正置在恒溫培養箱中30min左右后，倒置培養。

（3）待劃線的平板長出單克隆菌落，使用接種環挑取單個菌落，置于液體培養基中培養，通過測定OD600值調整至對數期。

（4）使用麥氏比濁管調整菌液濃度，一般地0.5麥氏濁度標準液大概菌數目約為1.5×108CFU/mL(圖1)，稀釋至1×106CFU/mL。

圖1 麥氏比濁管標準管近似濃度（引自https://www.bikeman-bio.com/chanpinzhanshi/8002.html）

（5）稀釋抗菌藥物（以異煙肼、利福平抗分枝桿菌為例）：在超凈工作臺以無菌的96孔板為藥物濃度梯度稀釋的容器，在96孔板上做好標記，首先在第一孔加入100μL藥物母液，后續剩余孔加入50μL液體培養基，然后從第一孔吸取50μL母液至第二孔，混勻后依次進行，最終形成藥物的濃度梯度。

（6）接著，接種菌液按照50μL/孔依次加入96孔板，其中菌濃度大約為5×105CFU/mL。

（7）設置陰性對照組（液體培養基+菌液）、陽性對照組（液體培養基）。

（8）培養：置于恒溫培養箱中培養并觀察菌的生長狀態。

（9）分析：根據定義通過肉眼觀察，其中使細菌無明顯生長的藥物濃度即為最低藥物濃度為MIC。

（10）測定MBC：基于MIC，我們選取包括最低藥物濃度MIC孔在內的更高藥物濃度的孔，吸取10~20μL，滴加在固體培養基瓊脂板上，使用涂布棒將其涂勻。

（11）將固體瓊脂板置于恒溫培養箱培養并觀察菌的生長狀態。

（12）分析：根據定義，我們通過技術瓊脂板上的單克隆菌落，尋找與接種菌量相比，生長的菌落數減少量≥99.9%的平板對應孔的藥物濃度即為最低藥物濃度MBC。

3. 注意事項

（1）操作過程中，要保證無菌操作，避免雜菌影響；全程要穿好實驗服、佩戴好手套、口罩。

（2）通常地，溶解抗菌藥物通常使用DMSO、乙醇等無菌溶劑，并過濾除菌后使用。

（3）使用麥氏比濁管的主觀性比較強，因此要充分搖勻麥氏比濁管后使用。

（4）對瓊脂板進行涂布和劃線時需要注意力度，要避免劃破瓊脂板。

（5）要注意設置重復組（通常3個），包括孔板藥物濃度設置，瓊脂板單克隆菌落計數。

（6）對稀釋的藥物濃度做好標記，避免混淆。