1. 實驗原理

細胞熱位移實驗（CETSA）的核心原理依賴于蛋白質對熱穩定性的不同響應。即配體與靶蛋白結合后，可提高蛋白的熱穩定性，使其在相同溫度下相比于天然蛋白更不容易發生變性。

相較于未結合藥物的游離蛋白，這類受配體保護的蛋白在同一溫度條件下能保持較高比例的天然結構，從而減少降解產物的產生。

（圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Cellular_thermal_shift_assay）

實驗過程中，通過在不同溫度條件下檢測蛋白的完整性或溶解性，可以間接評估藥物與靶蛋白的結合情況。這種方法廣泛用于鑒定小分子藥物的作用靶點，研究蛋白穩定性的調控機制，并在藥物篩選和機制研究中發揮重要作用。

2. 實驗材料

耗材：10cm培養皿、6cm培養皿、PCR管、6孔板

試劑：NP-40緩沖液、蛋白酶抑制劑、2×SDS Loading Buffer、SDS-PAGE凝膠試劑、DMSO

儀器：CO2培養箱、倒置熒光顯微鏡、PCR儀、離心機

3. 實驗步驟

3.1 細胞培養與處理

培養293T細胞，確保狀態良好，鋪6孔板，密度大約在70%左右，可根據實驗設計在細胞內轉染目的蛋白質粒。

3.2 藥物孵育

隨后將細胞暴露于DMSO或實驗藥物X中，37℃培養24 h，以確保藥物能夠充分與靶蛋白結合。

3.3 細胞收集與預處理

孵育結束后，收集細胞并用含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L PMSF或者50×cocktail）的PBS清洗2次。胰酶消化后離心棄上清，將細胞重懸于PBS（不含蛋白酶抑制劑）中，細胞計數以調整細胞密度至2×10? cells/mL。

3.4 溫度梯度處理

將細胞均分至多個PCR管中（50 μL），確保每管含有等量的細胞。使用PCR儀或加熱裝置，在一系列不同溫度梯度（如37℃至67℃）下加熱3 min，室溫冷卻3 min，并在冰上保持，使蛋白質發生不同程度的熱變性（做3個重復）。

3.5 細胞裂解與蛋白提取

熱處理結束后，使用NP-40緩沖液重懸細胞，并通過液氮凍融循環3次，以徹底裂解細胞并釋放蛋白質。然后，在4℃條件下，以20,000×g離心20 min，收集上清液，其中富含未變性的蛋白，而沉淀部分主要包含已變性的蛋白。

3.6 蛋白檢測

取20 μL上清液，與等量的2×SDS Loading Buffer混合，在金屬浴中加熱煮蛋白10 min，使蛋白充分變性。之后可進行Western blot實驗檢測目標蛋白的含量。如果需要更精細的蛋白質分析，可將上清送至專業機構進行質譜檢測，以解析蛋白的穩定性及藥物作用機制。

如圖為將裂解物與100μmol/L Dem一起孵育5-10 min，發現Dem在所有溫度下都顯著促進了USP22蛋白的降解，甚至在室溫下也是如此。 圖片

如圖為CETSA用于測定USP22與Dem（一種藥物）在短時間藥物暴露（5 min）下的一系列溫度范圍內相互作用的熱不穩定性[1]

4. 注意事項

作為對照組使用的DMSO，其終濃度應控制在不影響細胞生長的范圍（通常≤0.1%）；

加熱時間：通?？刂圃?-5 min，時間過短可能導致蛋白未充分變性，過長可能引起非特異性降解；

NP-40或Triton X-100緩沖液可用于溫和裂解，避免使用過強的裂解條件（如SDS），否則可能影響蛋白的穩定性；

液氮凍融即將8連排管緩慢放入液氮冷凍1-2 min，取出后迅速置于37℃恒溫水浴鍋使其融化，重復操作，共3次。

5. 參考資料

[1]Zhang Y, Huang Y, Yu D, Xu M, Hu H, Zhang Q, Cai M, Geng X, Zhang H, Xia J, Guo M, Lu D, Xu H, Li L, Zhang X, Wang Q, Liu S, Zhang W. Demethylzeylasteral induces PD-L1 ubiquitin-proteasome degradation and promotes antitumor immunity via targeting USP22 [J]. Acta pharmaceutica Sinica B, 2024, 14(10): 4312-4328.