1.通用測試方式（透析）

藥物、生長因子、外泌體這類活性物質的體外釋放行為監測均可通過透析法來檢測。具體如下：類似于圖1所示方法，釋放介質可選擇PBS、生理鹽水等，通常將負載活性物質的凝膠置于透析袋（PS:透析袋的截留分子量需大于活性物質的分子量）內，再將其浸于裝有釋放介質的離心管中，也可直接將凝膠置于釋放介質中。然后將透析裝置置于恒溫振蕩培養箱內，根據模擬機體環境要求設置相應參數（溫度、振蕩速度等）。在設定時間內對釋放介質取樣進行濃度測定，并補充相同體積、溫度和pH的釋放介質，使釋放介質的總體積保持不變。

圖1 透析法測試藥物負載型凝膠的藥物釋放行為[1]

2.藥物類檢測方法

1. OD值檢測法

若負載的藥物含有紫外、熒光吸收峰，可通過紫外光譜儀、熒光光譜儀、高效液相色譜儀（HPLC）等儀器計算釋放介質中的濃度。根據測得的數據計算藥物累積釋放率，并采用繪圖軟件繪制釋放曲線（PS:需首先建立目標藥物濃度與儀器吸光度值之間的標準曲線）。

2. 電化學方法

藥物釋放行為檢測中，電化學方法提供了快速原位測量的可能性，同時避免了釋放介質中未溶解分子的存在所造成的干擾。類似于圖2所示方法，可將負載藥物的凝膠置于三電極體系裝置中，原位實時監測釋放介質的藥物含量。如可利用方波伏安技術測定鹽酸阿霉素（DOX）的氧化還原反應進而測試DOX的釋放行為[2]。缺點是不同電化學測試方法的技術靈敏度和響應能力差別很大。此外，所使用的傳感器可能只針對特定的藥物[1]。

圖2 電化學測試DOX的釋放行為裝置圖[2]

3.生長因子類檢測方法

1. 酶聯免疫法（ELISA）

釋放介質中生長因子的定量檢測通常通過ELISA法實現，即對應的生長因子試劑盒檢測釋放介質中的目標生長因子含量[3]。

4.外泌體檢測方法

1. 免疫染色法

如何可視化監測水凝膠中負載的外泌體在釋放過程是否被細胞吞噬掉？可利用外泌體的本身結構特性（具有脂質雙層膜的微小囊泡）進行免疫著色后觀察。研究中常用PKH26外泌體紅色熒光標記染料對外泌體進行熒光標記，監測細胞吞噬作用[4]。

圖3 PKH26熒光標記外泌體在GelMA-PPY-Exosomes (GMPE)水凝膠及神經干細胞細胞質的可視化分布[4]

2. BCA法蛋白定量檢測

釋放介質中外泌體的釋放曲線通常采用BCA（二奎啉甲酸）法進行測定[5]。簡要原理為在堿性環境下外泌體中的蛋白質與Cu2+絡合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結合形成穩定的紫藍色復合物，在562nm處有較高的光吸收值并與蛋白質濃度成正比，據此可測定蛋白質濃度。

圖4 BCA法測試GelMA水凝膠中細胞外囊泡（sEVs）的釋放曲線[5]

3. 酶聯免疫法（ELISA）

研究表明，幾種四跨膜蛋白，尤其是CD63、CD81和CD9被認為是外泌體的標志物[6]，因此可選用對應的ELISA試劑盒進行定量測定外泌體的釋放曲線。

圖5 PKH67標記GelMA凝膠中HUVECs-Exos及ELISA法測試GelMA水凝膠中Exos的釋放曲線[8]

下面，列舉一些在檢測活性物質（藥物、生長因子、外泌體）的應用實例。

1. Advanced Healthcare Materials：GelMA-β-環糊精基微針貼片用于遞送疏水藥物

研究材料：羧甲基β-環糊精、GelMA

目標藥物：疏水性藥物-姜黃素

負載方式：姜黃素與環糊精的主客體包合作用

檢測方法：OD值檢測法，具體地，以VDPBS:DMSO=（4：1）為釋放介質測試微針貼片中姜黃素的釋放行為，通過紫外光譜儀定期檢測釋放介質中OD=430nm處的紫外吸收峰

研究結果：基于GelMA接枝β-環糊精的微針貼片。利用環糊精對疏水藥物的包載作用將抗癌藥物姜黃素負載到微針中，通過GelMA水凝膠模擬的黑色素瘤模型驗證了該載藥貼片的腫瘤治療效果[7]。

參考資料：

https://doi.org/10.1002/adhm.202000527

2. Advanced Healthcare Materials：3D打印水凝膠結構以調控生長因子的釋放

研究材料：甲基丙烯酸縮水甘油酯改性透明質酸（HA-GM）、巰基化肝素（Hep-SH）

目標生長因子：血小板衍生生長因子（PDGF）、血管內皮生長因子（VEGF）

負載方式：肝素與生長因子間的靜電作用

檢測方法：酶聯免疫（ELISA）法，具體地，以DPBS為釋放介質測試不同打印結構中生長因子的釋放行為，通過ELISA定期定量檢測生長因子

研究結果：裝載生長因子的水凝膠幾何形狀可以通過3D打印來實現，以便在長時間內預測生長因子的釋放動力學[3]。

參考資料：

https://doi.org/10.1002/adhm.201900977

3. Journal of Extracellular Vesicles：可釋放細胞外囊泡的GelMA基水凝膠用于軟骨再生

研究材料：GelMA、納米粘土(nanoclay)、小細胞外囊泡(hUC-MSCs-sEVs)

目標外泌體：人臍帶間充質干細胞衍生細胞外囊泡

負載方式：物理混合

檢測方法：BCA法蛋白定量檢測，具體地，以PBS為釋放介質，通過BCA法定期定量檢測外泌體的釋放曲線

研究結果：GelMA/nanoclay水凝膠持續釋放sEV，具有刺激軟骨形成和治愈軟骨缺損的能力，在治療軟骨缺損方面具有廣闊的前景[5]。

參考資料：

https://doi.org/10.1080/20013078.2020.1778883

參考文獻：

[1] D’Souza, Susan. "A review of in vitro drug release test methods for nano-sized dosage forms." Advances in Pharmaceutics 2014 (2014).

[2] Mora, Laura, et al. "Real-time electrochemical monitoring of drug release from therapeutic nanoparticles." Journal of Controlled Release 140.1 (2009): 69-73.

[3] Wang, Pengrui, et al. "Controlled Growth Factor Release in 3D‐Printed Hydrogels." Advanced healthcare materials 9.15 (2020): 1900977.

[4] Fan, Lei, et al. "Exosomes‐Loaded Electroconductive Hydrogel Synergistically Promotes Tissue Repair after Spinal Cord Injury via Immunoregulation and Enhancement of Myelinated Axon Growth." Advanced Science (2022): 2105586.

[5] Hu, Hongxing, et al. "miR-23a-3p-abundant small extracellular vesicles released from Gelma/nanoclay hydrogel for cartilage regeneration." Journal of extracellular vesicles 9.1 (2020): 1778883.

[6] Mathieu, Mathilde, et al. "Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9." Nature communications 12.1 (2021): 1-18.

[7] Zhou, Xingwu, et al. "Biodegradable β‐Cyclodextrin Conjugated Gelatin Methacryloyl Microneedle for Delivery of Water‐Insoluble Drug." Advanced healthcare materials 9.11 (2020): 2000527.

[8] Zhao, Danyang, et al. "GelMA combined with sustained release of HUVECs derived exosomes for promoting cutaneous wound healing and facilitating skin regeneration." Journal of Molecular Histology 51.3 (2020): 251-263.