1. 實(shí)驗(yàn)原理

腦立體定位注射是基于三維立體坐標(biāo)系統(tǒng)（X，Y，Z軸），通過(guò)顱骨上的解剖學(xué)標(biāo)志（如前囟、后囟、顱縫等）確定大腦內(nèi)部目標(biāo)區(qū)域的精確位，將藥物、病毒載體或其他物質(zhì)注入大腦特定區(qū)域的技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究和臨床治療。

2. 實(shí)驗(yàn)材料

耗材：玻璃微電極、1 mL注射器、棉簽

試劑：病毒（通常-80℃液氮凍存，避免反復(fù)凍融；比需要注射的體積多300 nL左右）、生理鹽水（0.9% NaCl溶液）、3M組織膠

設(shè)備：玻璃微電極拉制儀、腦立體定位儀、注射泵和它相應(yīng)的控制器、加熱墊

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

吸取病毒→固定小鼠→定位調(diào)平→鉆孔開顱→注射病毒→留針→術(shù)后處理

3.1 吸取病毒

用微電極拉制儀上設(shè)定好的程序拉制玻璃微管，將玻璃微電極的尖端剪短，并用石蠟油填充滿直至溢出；

將它裝在注射泵上，控制器控制泵打出少許（200 nL）體積的石蠟油以判別氣密性是否完好；

若石蠟油可以打出表示氣密性完好，之后用含有生理鹽水的注射器清洗玻璃微電極的針尖，然后吸取病毒（速度50-80 nL/min）。

3.2 固定小鼠

將麻醉好的小鼠固定在腦立體定位儀上，先將小鼠前門齒卡入適配器的孔再將上方旋鈕擰緊；

用耳桿穿過(guò)小鼠的耳朵尋找合適的卡點(diǎn)，注意耳桿的距離等長(zhǎng)，也不要用蠻力，不然小鼠會(huì)被夾死。

3.3 定位調(diào)平

剪開小鼠的頭皮，尋找bregma點(diǎn)即冠狀縫與矢狀縫的交匯點(diǎn)，以及l(fā)ambda點(diǎn)即人字縫與矢狀縫的交匯點(diǎn)，定位兩點(diǎn)在同一高度即可（一般不會(huì)超過(guò)0.05 mm）；

左右調(diào)平，判別bregma點(diǎn)之后1.8 mm左右旁開1.5 mm的兩個(gè)點(diǎn)的高度是否一致（一般不會(huì)超過(guò)0.05 mm），若不一致，調(diào)節(jié)左右的升降旋鈕進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3.4 鉆孔開顱

調(diào)平之后，用玻璃微電極的尖端與bregma點(diǎn)調(diào)齊定義零點(diǎn)；

然后調(diào)節(jié)定位儀定位目標(biāo)腦區(qū)，例如NAc（AP：1.4 mm；mL：±1.2 mm；DV：4.2 mm），用注射器尖端標(biāo)記一下顱骨上的位置，用無(wú)菌骨鉆（參考轉(zhuǎn)數(shù)10000rpm）緩慢打磨顱骨鉆孔（避免電鉆鉆到腦）。

3.5 注射病毒

玻璃微電極緩慢下降看針尖能否落到鉆的小孔中，若能，在針尖接觸到腦膜的時(shí)候定義深度的零點(diǎn)；

然后緩慢下降（0.02 mm/s）到目標(biāo)腦區(qū)深度（例如NAc，4.2 mm），用注射泵的控制器注射病毒（一般體積在300-500 nL，速度一般在30-50 nL/min）。

3.6 留針

待病毒注射完后，靜置5-10 min即可出針；

清理顱骨上的雜質(zhì)，縫合頭皮，在縫合處點(diǎn)上組織膠（利于小鼠恢復(fù)），之后取下小鼠將其放在加熱墊上等待其蘇醒。

3.7 術(shù)后處理

顯微鏡下檢查縫合情況；

腦部組織回位：輕柔按壓周圍組織消除氣隙；

蘇醒監(jiān)測(cè)：記錄恢復(fù)時(shí)間（正常范圍5-15 min）。

4. 注意事項(xiàng)

玻璃微電極尖端的長(zhǎng)度注意控制，太長(zhǎng)吸取病毒或打出病毒的時(shí)候容易堵塞，太短的話無(wú)法伸到目標(biāo)腦區(qū)；

注射病毒前觀察病毒是否能打出來(lái)，避免耽誤時(shí)間；

注射病毒的時(shí)候注意觀察病毒是否從腦沿針尖溢出。

5. 參考資料

[1] Dudek KA, Paton SEJ, Binder LB, et al. Astrocytic cannabinoid receptor 1 promotes resilience by dampening stress-induced blood-brain barrier alterations. Nat Neurosci.

[2] Zhou K, Xu H, Lu S, et al. Reward and aversion processing by input-defined parallel nucleus accumbens circuits in mice. Nat Commun. 2022;13(1):6244.