各位小伙伴大家好，瓊脂糖凝膠電泳作為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最為基礎(chǔ)而常用的技術(shù)，從而在實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用，所以學(xué)會(huì)瓊脂糖凝膠電泳是進(jìn)入分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的必要技巧之一。

 

接下來(lái)我將著點(diǎn)于，實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)步驟、注意事項(xiàng)以及疑難解答等幾個(gè)方面向各位小伙伴們?cè)敿?xì)闡述。

 

實(shí)驗(yàn)原理

 

電泳即利用化合物的分子量或帶電荷量在穩(wěn)定電場(chǎng)中所受阻力或者電場(chǎng)力的不同，從而遷移效率不同，來(lái)達(dá)到分離化合物的目的。而瓊脂糖凝膠電泳，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是以瓊脂糖凝膠作為電泳介質(zhì)來(lái)承載化合物進(jìn)行電泳。瓊脂糖是D-和L-半乳糖殘基通過(guò)α(1→3)和β(1→4)糖苷鍵交替構(gòu)成的線狀聚合物。瓊脂糖鏈形成螺旋纖維，后者再聚合成半徑20~30nm的超螺旋結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠可以構(gòu)成一個(gè)直徑從50nm到略大于200nm的三維篩孔的通道，從而給予化合物分子可以通過(guò)的空間以及一定的阻力。

 

影響DNA的遷移效率的因素

 

1、通過(guò)凝膠的電流與電壓

 

根據(jù)歐姆定律，V= IR因?yàn)橛糜陔娪镜木彌_液通常是微堿性的(pH 7.8~8.0)，通過(guò)凝膠的DNA分子攜帶負(fù)電荷，并以所施加的電流形成的速率向陽(yáng)極遷移。

 

低電壓時(shí)，線狀DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。但是，電場(chǎng)強(qiáng)度升高時(shí)，高分子質(zhì)量DNA片段的遷移率不成比例增加。所以，當(dāng)電壓增大時(shí)，瓊脂糖凝膠分離的有效范圍反而減小。要獲得大于2kb DNA片段的良好分辨率，則所用電壓不應(yīng)高于5~8V/cm。

 

2、DNA分子的大小

 

雙鏈DNA分子在凝膠基質(zhì)遷移的速率與其堿基對(duì)數(shù)的常用對(duì)數(shù)成反比。大分子DNA摩擦阻力大，通過(guò)凝膠孔徑的效率低于小分子DNA，因此遷移速率慢。

 

3、瓊脂糖濃度

 

瓊脂糖凝膠是由氫鍵和疏水作用聚合在一起的多孔膠體。在電流的作用下，DNA線性分子通過(guò)一系列孔徑泳動(dòng)，這些孔徑的有效直徑取決于凝膠中瓊脂糖的濃度。在DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)和凝膠濃度之間存在線性關(guān)系。

 

4、DNA的構(gòu)象

 

超螺旋環(huán)狀(I型)、切口環(huán)狀(II型)和線性(I型) DNA在瓊脂糖凝膠中遷移速率不同。絕大多數(shù)情況下，區(qū)分不同構(gòu)象DNA的最佳方式是在電泳系統(tǒng)中加入未處理的環(huán)狀DNA樣品和在單一限制酶切位點(diǎn)經(jīng)酶切消化后的同一線狀DNA樣品。

 

5、凝膠和電泳緩沖液中的染料

 

染料插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少，而剛性和長(zhǎng)度增加。因此,線狀DNA-染料復(fù)合物在凝膠中的遷移率約降低15%。

 

6、瓊脂糖種類

 

常見(jiàn)的瓊脂糖主要有兩種:標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點(diǎn)瓊脂糖。正在研制的第三種是熔點(diǎn)和凝點(diǎn)介于，上述二者之間的瓊脂糖，它兼有兩者的特性。每一大類中都有不同種類的瓊脂糖用于不同的分離目的。

 

7、電泳緩沖液

 

DNA的泳動(dòng)受電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度的影響。缺乏離子(如用水替代電泳槽及凝膠中的緩沖液)則電導(dǎo)率降至很低，DNA遷移極慢，或者完全不動(dòng)。高離子強(qiáng)度時(shí)，如錯(cuò)用了10X電泳緩沖液，電導(dǎo)率升高，即使應(yīng)用適中的電壓也會(huì)產(chǎn)生大量的熱量。最嚴(yán)重時(shí)凝膠會(huì)熔化，DNA會(huì)變性。

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

1、選擇合適的塑料托盤，置于潔凈的制膠模具中，并置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。

 

2、配制足量的電泳緩沖液(1×TAE或0.5×TBE)用以灌滿電泳槽和配制凝膠。

 

▲配膠和灌滿電泳槽使用同一批緩沖液很重要。因?yàn)榧词购苄〉碾x子強(qiáng)度或pH差別也會(huì)導(dǎo)致凝膠性能異常，嚴(yán)重影響DNA片段的泳動(dòng)。當(dāng)檢測(cè)未知DNA片段的大小時(shí)，一定要保證所有樣品在同一緩沖液配置的同樣凝膠中分析。

 

3、根據(jù)欲分離DNA片段大小，用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液:應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中。

 

▲緩沖液體積應(yīng)小于燒瓶或玻璃瓶容積的50%。

 

▲分離不同大小的DNA所需的瓊脂糖凝膠濃度如表。一些高分辨率瓊脂糖凝膠能分離只有幾個(gè)堿基對(duì)差別的DNA。此外，經(jīng)修飾的多糖加到瓊脂糖中可以增加分辨率。修飾多糖與瓊脂糖混合制成的濃度為0.5%~2.0% (m/V)的凝膠不僅分辨率增加，而且更清亮，強(qiáng)度更好。

表1 不同含量標(biāo)準(zhǔn)低電內(nèi)滲瓊脂糖凝膠的分離范圍

 

▲警惕:微波爐加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，瓊脂糖溶液會(huì)變得過(guò)熱或劇烈沸騰。

 

▲僅加熱所有瓊脂糖顆粒完全溶解需要的最短時(shí)間。通常未熔解的瓊脂糖呈小透明體或半透明碎片懸浮在溶液中。戴上手套，不時(shí)地小心旋轉(zhuǎn)三角燒瓶或玻璃瓶，以保證黏在壁上的未熔化的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。

 

▲熔解較高濃度的瓊脂糖需要較長(zhǎng)的加熱時(shí)間。

 

▲要查看煮沸后是否由于蒸發(fā)而溶液體積減少，如有必要用水恢復(fù)原體積。

 

4、待熔化的凝膠稍冷卻后加入熒光染料（如：溴化乙錠，終濃度為0.5μg/mL；或按照使用說(shuō)明加入其他染料）。輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。

 

▲警惕: SYBR Gold不應(yīng)加到熔化的凝膠溶液中。

 

▲熒光染料也可以直接混入樣品，或者待電泳結(jié)束后浸泡染色。

 

5、瓊脂糖溶液正在冷卻時(shí)，選擇一個(gè)合適的梳子用來(lái)制造加樣孔。梳齒底部的位置應(yīng)在托盤底面，上0.5~1.0mm,這樣瓊脂糖澆灌到托盤時(shí)將形成符合要求的加樣孔。

 

▲多數(shù)凝膠托盤都有適宜放梳子的側(cè)壁或外側(cè)支架。如果沒(méi)有或不合適，梳齒可能會(huì)太接近托盤底面，在拔出梳子時(shí)易穿透加樣孔的底部，樣品液將從凝膠和加樣孔之間泄露。

 

6、澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具。

 

▲凝膠適宜厚度為3~5mm。需檢查在梳齒下或梳齒間應(yīng)無(wú)氣泡。熔化的凝膠液中的氣泡用擦拭紙的角輕觸或使用移液槍即可容易除去。

 

▲制備低濃度瓊脂糖凝膠(<0.5%)時(shí)，先倒一個(gè)1%濃度瓊脂糖的支持膠，它沒(méi)有加樣孔。讓支持膠在托盤或玻璃板上室溫下硬化,然后再直接在支持膠.上倒低濃度凝膠。此方式制備的凝膠明顯減少了在后續(xù)如照相或Southern雜交等操作過(guò)程中可能造成的低濃度膠斷裂。需要保證兩個(gè)濃度的凝膠用同一批緩沖液配制，且含有相同濃度的染料。低熔點(diǎn)和低于0.5%濃度的瓊脂糖凝膠也可以冷卻到4°C，并在冷室中電泳以減少斷裂的機(jī)會(huì)。

 

7、讓凝膠溶液完全凝結(jié)，室溫下需30~45min。加少量電泳緩沖液于凝膠頂部，小心拔出梳子。將凝膠安放到電泳槽內(nèi)。

 

8、向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒(méi)過(guò)凝膠約1mm。

 

▲沒(méi)有必要在加樣前對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行預(yù)電泳。

 

9、將DNA樣品和對(duì)應(yīng)體積的上樣緩沖液混合（常用的DNA上樣緩沖液有10×、6×等）。

 

▲加樣孔能加入DNA的最大量取決于樣品中DNA片段的大小和數(shù)目。若一個(gè)5mm寬條帶含有500ng以上的DNA時(shí)，說(shuō)明加樣孔過(guò)載，會(huì)導(dǎo)致拖尾、條帶兩側(cè)卷翹的“微笑效應(yīng)”和模糊不清等現(xiàn)象。如果DNA長(zhǎng)度增加，上述現(xiàn)象變得更為嚴(yán)重。分析單一DNA樣品(如λ噬菌體或質(zhì)粒DNA)時(shí)，每個(gè)5mm寬加樣孔可加100~ 500ng，DNA。如果樣品由不同大小的許多DNA片段組成(如哺乳類動(dòng)物DNA的酶切樣品),則每個(gè)加樣孔加入20~30μg的DNA也不會(huì)造成分辨率明顯下降。

 

▲加樣DNA的最大體積是由加樣孔容積決定的。通用的加樣孔(0.5cm×0.5cm×0.15cm)可容納約40μL樣品。切忌將加樣孔加得太滿，甚至溢出。為避免溢出造成鄰孔樣品污染，最好配置稍厚些的凝膠能夠增加加樣孔容積或通過(guò)乙醇沉淀濃縮DNA減少加樣體積。

 

10、用一次性吸頭、自動(dòng)移液器、拉長(zhǎng)的巴斯德吸管或玻璃毛細(xì)管將樣品混合液緩慢加至浸沒(méi)凝膠的加樣孔內(nèi)。DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)的兩個(gè)孔內(nèi)。

 

11、關(guān)上電泳槽蓋,接好電極插頭。DNA應(yīng)向陽(yáng)極(紅色插頭)側(cè)泳動(dòng)。給予1~8V/cm的電壓，其中距離以陽(yáng)極至陰極之間的測(cè)量為準(zhǔn)。如電極插頭連接正確，陽(yáng)極和陰極由于電解作用將產(chǎn)生氣泡，并且?guī)追昼妰?nèi)溴酚藍(lán)從加樣孔遷移進(jìn)入膠體內(nèi)。待溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)FF遷移到適當(dāng)距離后停止電泳。

 

▲溴化乙錠的存在使凝膠在電泳的任何階段都能夠置于紫外燈下觀察。此時(shí)，可以除去托盤，直接放凝膠于透光板上。也可以用一個(gè)手提式紫外光源檢查凝膠。不管哪種方式，應(yīng)在檢查時(shí)短時(shí)間關(guān)閉電源。

 

▲電泳期間，溴化乙錠向陰極遷移(與DNA遷移方向相反)。長(zhǎng)時(shí)間電泳將導(dǎo)致凝膠中溴化乙錠含量顯著減少,使小片段DNA檢測(cè)發(fā)生困難。此時(shí)，可將凝膠浸入0.5μg/mL溴化乙錠溶液染色30~45min。

 

12、當(dāng)DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時(shí)，關(guān)上電源、拔出電極插頭并打開(kāi)電泳槽蓋。若凝膠和電泳緩沖液中含有溴化乙錠，用紫外燈觀察凝膠和用裝有紫外線透射濾光片的CCD相機(jī)照相。

 

13、凝膠電泳結(jié)束后可進(jìn)行切膠回收DNA，也可以進(jìn)一步進(jìn)行Southern印跡分析。

 

疑難解答

 

1. 使用水代替凝膠緩沖液或電泳緩沖液

 

瓊脂糖凝膠配制和電泳通常使用TAE或TBE緩沖液進(jìn)行。如果您使用水進(jìn)行凝膠配制和跑電泳，您的凝膠將在電泳時(shí)很快融化。TAE、TBE和水都是透明的溶液；因此，在配制時(shí)請(qǐng)檢查容器的標(biāo)簽。

 

2. 使用了錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖

 

DNA凝膠電泳所需的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖濃度為1.0%。濃度越高，小條帶的分辨率越高；反之，瓊脂糖濃度越低，大分子量條帶的分辨率和分離程度越高。如果使用了錯(cuò)誤濃度的瓊脂糖凝膠，就很難確定DNA條帶的可靠性。當(dāng)使用低百分比濃度瓊脂糖凝膠時(shí)要小心；它們往往較軟，更容易破損。

 

3. 顛倒了電泳槽與電源連接線的方向

 

這是很容易犯的錯(cuò)誤，但是如果你不小心顛倒了電泳槽與電源連接線的方向，結(jié)果將會(huì)非常令人沮喪。因?yàn)闃颖緯?huì)向相反方向移動(dòng)，而且由于上樣孔與凝膠的末端很近，您會(huì)丟失所有的樣本。開(kāi)始您的電泳后確保DNA樣本以正確的方向進(jìn)入凝膠；如果您看到您的條帶向錯(cuò)誤的方向移動(dòng)，請(qǐng)顛倒電源線的方向。

 

4. 什么是適合于您的瓊脂糖凝膠電泳的正確緩沖液？

 

進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳所需的緩沖液類型，主要取決于DNA片段大小和電泳后的應(yīng)用。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳最常見(jiàn)的兩種緩沖液是Tris-乙酸EDTA緩沖液（TAE）和Tris-硼酸EDTA緩沖液（TBE）。因?yàn)閮煞N緩沖液的pH值都接近中性，所以緩沖液中的DNA都帶凈負(fù)電荷并向凝膠裝置正極(+)方向移動(dòng)。

 

對(duì)于小片段DNA (<1000 bp)，如果沒(méi)有計(jì)劃從凝膠中回收DNA，那么推薦使用1×TBE緩沖液。TBE溶液具有高離子強(qiáng)度和緩沖能力。TAE緩沖液，結(jié)合低電場(chǎng)強(qiáng)度（1–2 V/cm），最適于分離大DNA（12–15 kb）。TAE緩沖液與瓊脂糖相互作用，相比較TBE緩沖液中的瓊脂糖凝膠，會(huì)產(chǎn)生更低的電滲透，更大的表面孔經(jīng)，和更低的電場(chǎng)強(qiáng)度，可降低大DNA的smear現(xiàn)象。

 

5. 為了獲得最好的分辨率您需要的DNA上樣量是多少？

 

DNA樣本量可以是各種各樣的，關(guān)鍵是您正在分離的DNA條帶的DNA含量。最小可能被檢測(cè)的DNA的量依賴于所使用的染色方法（例如，使用SYBR Safe DNA凝膠染色可以檢測(cè)出 3 ng的DNA。一個(gè)清晰且界限分明的條帶中DNA最大量為100 ng。

 

6. 凝膠配制如何影響條帶分辨率？

 

推薦的瓊脂糖凝膠厚度為3-4 mm；厚度超過(guò)5mm的凝膠會(huì)產(chǎn)生模糊的條帶和更高的染色背景。與此類似，覆蓋在電泳裝置中凝膠上的電泳緩沖液厚度為3-5mm。緩沖液太多會(huì)降低DNA遷移率并造成條帶變形。

 

梳齒的厚度也很重要，它會(huì)顯著影響分辨率。薄梳(1 mm)會(huì)給出界限清晰的條帶，而厚梳會(huì)產(chǎn)生厚條帶，導(dǎo)致分辨率降低。梳齒應(yīng)充分清洗以去掉可能的殘留物，否則可能會(huì)在泳道內(nèi)產(chǎn)生波浪線。此外，在去除梳齒前要先加入緩沖液，以減少瓊脂糖孔附近的撕裂。

 

7. 凝膠類型影響條帶分辨率嗎？

 

根據(jù)DNA的應(yīng)用和大小，瓊脂糖類型會(huì)影響DNA分辨率。凝膠強(qiáng)度，凝膠融解溫度，和電滲透是選擇合適瓊脂糖時(shí)的重要因素。

 

8. 您如何選擇瓊脂糖凝膠電泳運(yùn)行環(huán)境？

 

推薦的凝膠電泳裝置內(nèi)的電壓是4–10 V/cm（正極和負(fù)極之間的距離，不是凝膠長(zhǎng)度）。如果電壓太低，遷移率會(huì)降低，而且條帶會(huì)因擴(kuò)散而變寬。如果電壓太高，條帶分辨率會(huì)降低，這主要是由于凝膠過(guò)熱引起的。

 

9. 若DNA條帶呈微笑狀、波浪形怎么處理？

 

一般考慮膠質(zhì)不均導(dǎo)致的，可以適當(dāng)提高灌膠溫度，選用小分子核酸染料，不在跑膠時(shí)進(jìn)行染色、換在電泳結(jié)束后進(jìn)行泡染（將凝膠浸入0.5μg/mL溴化乙錠溶液染色30~45min）。