隨著基因診斷技術(shù)和對疾病分子機(jī)制認(rèn)識的發(fā)展，RNA療法正逐漸成為一種新的、非常有前途的治療方法，用于個性化和精準(zhǔn)醫(yī)療，可治療罕見病和常見疾病。全球已上市寡核苷酸藥物見表1,共14個藥物，其中12個均在2016年之后上市。

寡核苷酸藥物通過與信使RNA(mRNA)互補(bǔ)結(jié)合，干擾mRNA轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)發(fā)揮藥效，通常每條鏈上含有12～30個經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸亞基。關(guān)于寡核苷酸藥物是按照生物制劑還是化學(xué)藥品申報注冊，目前國內(nèi)尚無明確規(guī)定；美國FDA認(rèn)為化學(xué)合成寡核苷酸與小分子更類似，將其按照化學(xué)藥由藥品評估和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research, CDER)監(jiān)管，而基于載體或啟動子驅(qū)動的寡核苷酸藥物則按照生物制劑由生物制品評價和研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research, CBER)監(jiān)管。由于寡核苷酸藥物的分子尺寸介于小分子和生物制劑之間，且制造工藝相比普通小分子更復(fù)雜，多個國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(ICH)研究指導(dǎo)原則(Q3A,Q3B,Q6)的適用范圍明確將寡核苷酸藥物排除在外，國內(nèi)外亦尚無針對寡核苷酸藥物藥學(xué)研究的專門指導(dǎo)原則。

美國FDA曾指出關(guān)于寡核苷酸藥物的監(jiān)管存在以下挑戰(zhàn):① 對于質(zhì)量研究和標(biāo)準(zhǔn)制定方面均無明確指導(dǎo)原則。② 由于寡核苷酸藥物的多樣性，包括單鏈反義寡核苷酸、剪接調(diào)節(jié)劑、適配體和免疫調(diào)節(jié)劑、雙鏈siRNA(通過RNAi機(jī)制發(fā)揮作用)等，而這些不同作用機(jī)制的藥物會有不同的毒理學(xué)特征，從而導(dǎo)致不同的問題。③ 對于雜質(zhì)的鑒定限和質(zhì)控限尚無明確共識。④ 雜質(zhì)表征存在困難，由于寡核苷酸雜質(zhì)與主成分性質(zhì)非常接近，導(dǎo)致分析方法對于雜質(zhì)之間及雜質(zhì)與主成分之間的分離能力存在很大挑戰(zhàn)。

本文討論的范圍是化學(xué)合成的寡核苷酸藥物，不包括通過重組和酶法制備的mRNA等。本文將結(jié)合已上市化學(xué)合成寡核苷酸藥物的審評報告、歐洲制藥業(yè)成立的寡核苷酸聯(lián)盟(EPOC)發(fā)布的一系列技術(shù)白皮書、相關(guān)文獻(xiàn)等進(jìn)行分析，對化學(xué)合成寡核苷酸原料藥(API)所用起始物料的藥學(xué)研究進(jìn)行探討，以期為國內(nèi)化學(xué)合成寡核苷酸藥物的研發(fā)提供參考。本文中所闡述的觀點除明確有官方出處外，其余均為個人觀點，不作為藥品申報的依據(jù)。

1、已上市寡核苷酸藥物及其化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾

天然核苷酸成藥性方面存在以下問題：① 體內(nèi)穩(wěn)定性差。② 難以被靶細(xì)胞攝取。③ 脫靶效應(yīng)。因此，需對天然核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，以增加穩(wěn)定性、提高對靶點的親和力、促進(jìn)細(xì)胞攝取，并提高體內(nèi)的生物利用度。

寡核苷酸藥物的化學(xué)修飾可分為3類：① 核苷酸間鏈接的修飾：最常見的為硫代磷酸酯修飾，其中磷酸二酯鍵中的氧被硫取代，由于硫代磷酸酯為手性結(jié)構(gòu)，這也通常會導(dǎo)致API由2n(n為硫代數(shù)量)個非對映異構(gòu)體組成。② 糖環(huán)的修飾：由于核糖的2′位為羥基，對其進(jìn)行修飾還可以防止副反應(yīng)的發(fā)生，常見的修飾包括：2′-OMe, 2′-F,2′-O-MOE(甲氧乙基)、2′-脫氧；此外，還有采用嗎啉環(huán)代替糖環(huán)的修飾方式(如已上市的viltolarsen, golodirsen, eteplirsen)以及2′,4′形成橋環(huán)的修飾方式。③ 雜環(huán)堿基的修飾：常見的修飾包括嘧啶環(huán)上C5位甲基取代。

除了前述的化學(xué)修飾外，結(jié)構(gòu)優(yōu)化的另一個有效方式是與綴合物偶聯(lián)，以改善寡核苷酸藥物在特定組織的分布和細(xì)胞攝取，綴合物可以是多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、適配體和膽固醇、生育酚或葉酸等小分子，目前已有多個靶向肝臟的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)綴合物偶聯(lián)寡核苷酸藥物獲批上市，GalNAc可以降低毒性、提高藥效、改善藥動學(xué)(PK)性質(zhì)、降低脫靶效應(yīng)。此外，遞送系統(tǒng)也是非常重要和熱門的研究及應(yīng)用領(lǐng)域，可以改善寡核苷酸藥物在體內(nèi)分布、細(xì)胞攝取并降低毒性，如已上市藥物patisiran采用納米脂質(zhì)體(LNP)遞送。遞送系統(tǒng)屬于制劑的范疇，不在本文討論范圍。

經(jīng)查詢歐洲EMA的官方評估報告(EPAR),本文總結(jié)了歐盟上市寡核苷酸藥物API的結(jié)構(gòu)特點、制備方法、制劑類型及處方，見表2。

可以看出所有寡核苷酸藥物均采用固相合成工藝，制劑均為注射液(給藥途徑包括皮下注射、靜脈注射、鞘內(nèi)注射)且大部分為簡單溶液型注射液。這些寡核苷酸藥物在磷酸酯、核糖、堿基結(jié)構(gòu)以及鏈末端(綴合物)均有不同程度的修飾。

2、固相合成工藝

寡核苷酸API采用固相合成工藝(見圖1),在裝有固相載體(成分為化學(xué)修飾的樹脂或玻璃)的填充柱上通過計算機(jī)編程控制進(jìn)行自動化合成，整個寡核苷酸樹脂的合成是連續(xù)進(jìn)行的。

固相合成具有穩(wěn)定、高產(chǎn)率、高化學(xué)選擇性以及廣泛的洗滌步驟優(yōu)勢，合成結(jié)果高度可控及可預(yù)測，整個制備工藝包括6步。

① 從3′到5′端在固相載體上逐步偶聯(lián)核苷酸(通常采用保護(hù)的核苷亞磷酰胺進(jìn)行),得到寡核苷酸樹脂，每個循環(huán)包括：脫除核糖5′的DMT保護(hù)基，暴露核糖的5′-OH連接位點；與下一個核苷亞磷酰胺偶聯(lián)得到亞磷酸二酯；亞磷酸二酯不穩(wěn)定，需將Ⅲ價的磷氧化為V價的磷酸酯(P=O)或硫代磷酸酯(P=S);封端/帶帽，加入酰化試劑，以封蓋由于不完全偶聯(lián)或脫保護(hù)副反應(yīng)而殘留的任何未反應(yīng)的羥基中心，從而防止此類雜質(zhì)的傳遞。

靶向配體可以類似的方式偶聯(lián)至樹脂上，最后一個核苷酸的DMT保護(hù)基可在該步或者裂解后進(jìn)行脫除；在偶聯(lián)完成后，胺洗可脫除主鏈保護(hù)基(常見為磷羥基的氰乙基保護(hù)基),得到堿基被保護(hù)的寡核苷酸樹脂。

對于20聚體寡核苷酸，這意味著共有80個合成步驟依次進(jìn)行，過程中沒有分離的中間體，因此在以上每一步反應(yīng)后都要用溶劑對樹脂進(jìn)行多次洗滌，以去除多余的物料，避免殘留至后續(xù)步驟中生成雜質(zhì)。

② 用氨水處理可以脫除堿基上氨基的保護(hù)基，同時將寡核苷酸從樹脂上裂解下來，將寡核苷酸與樹脂分離，得到單鏈寡核苷酸粗品。

③ 粗品經(jīng)過液相色譜純化，通常采用強(qiáng)陰離子交換色譜柱(SAX)。與API非密切相關(guān)的雜質(zhì)(如鏈長度顯著不同于API的雜質(zhì))在色譜純化步驟中很容易被分離，但此步驟中不會去除鏈長度為全長(或接近全長)的寡核苷酸雜質(zhì)。

④ 脫鹽/濃縮：通過超濾/滲濾來交換反離子(如果需要)并濃縮寡核苷酸溶液。可通過配備膜的切向流過濾設(shè)備實現(xiàn)，根據(jù)膜的孔徑截止尺寸去除殘留的有機(jī)溶劑、鹽和低分子量雜質(zhì)。或者可以進(jìn)行一系列基于乙醇的寡核苷酸沉淀及隨后從水中復(fù)溶去除低分子量雜質(zhì)和濃縮寡核苷酸。

⑤ 單鏈寡核苷酸通過退火(加熱到高溫，再緩慢降溫)形成雙鏈寡核苷酸，若API為單鏈，則無需退火。

⑥ 寡核苷酸溶液通過凍干的方式得到固體API。

3、起始物料

3.1 起始物料的選擇

由于寡核苷酸藥物制造工藝的復(fù)雜性，API中存在的寡核苷酸類雜質(zhì)譜的復(fù)雜性，雜質(zhì)研究、表征和控制的挑戰(zhàn)性及局限性，要保證API批間質(zhì)量的一致性，遵循從源頭控制質(zhì)量的理念和良好的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)生產(chǎn)是非常重要的,因此起始物料的控制是關(guān)鍵的一環(huán)。

ICH Q11為評估起始物料對成品質(zhì)量的影響程度提供了科學(xué)的基于風(fēng)險的框架，雖然ICH Q11明確指出寡核苷酸不在范圍之內(nèi)，但其中概述的起始物料選擇的理念仍然適用。

歐盟上市寡核苷酸藥物的審評報告說明申請人參照ICH Q11選擇了合理的起始物料，審評報告中披露的起始物料選擇策略見表2,除inotersen和nusinersen未提及外，其他所有寡核苷酸藥物均選擇保護(hù)的核苷亞磷酰胺作為起始物料(文中的核苷亞磷酰胺、酰胺、保護(hù)的酰胺等措辭均指保護(hù)的核苷亞磷酰胺),另外，有2個品種明確將預(yù)加載一個亞基的固相載體作為起始物料。

EPOC聯(lián)盟在其技術(shù)白皮書中指出，核苷亞磷酰胺采用標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)制造方法，質(zhì)量良好的核苷亞磷酰胺物料已能從第三方供應(yīng)商處廣泛獲得，其作為起始物料已被廣泛接受。但是對于綴合物以及預(yù)加載亞基的固相載體作為起始物料尚無明確共識，隨著商業(yè)化的可及性及對起始物料質(zhì)量認(rèn)知的深入，可能會逐漸形成共識。總之，應(yīng)參照ICH Q11對起始物料選擇的合理性進(jìn)行論證。

值得注意的是，多個寡核苷酸藥物的歐盟審評報告中均指出，若將來新增起始物料供應(yīng)商，在變更獲得官方批準(zhǔn)后才能實施(歐盟根據(jù)風(fēng)險將上市后變更分為一般變更和重大變更，重大變更需經(jīng)過監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)后才能實施),可見監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)為寡核苷酸藥物中起始物料供應(yīng)商變更對產(chǎn)品質(zhì)量帶來的風(fēng)險較大。這種風(fēng)險源于起始物料中的關(guān)鍵雜質(zhì)會通過相似的合成路徑衍生至API中，成為與API同樣長度的關(guān)鍵雜質(zhì)，且不易通過純化去除。對于一種20聚寡核苷酸藥物，若每個起始物料核苷亞磷酰胺中含有某一類關(guān)鍵雜質(zhì)，即使在起始物料中的含量水平僅0.05%,最終會在API中生成1.0%(20×0.05%)的雜質(zhì)。因此，起始物料應(yīng)盡可能不存在關(guān)鍵雜質(zhì)，一方面是為了保證API的質(zhì)量，另一方面雜質(zhì)的產(chǎn)生會造成高昂成本浪費。總之，選擇能提供良好質(zhì)量的起始物料供應(yīng)商是非常重要的，對于起始物料供應(yīng)商的變更應(yīng)進(jìn)行充分的評估和研究。

3.2 起始物料的質(zhì)量控制

起始物料根據(jù)其類型可分為核苷亞磷酰胺(脫氧酰胺、2′修飾酰胺、復(fù)雜酰胺)、綴合物酰胺、預(yù)加載亞基的固相載體，應(yīng)根據(jù)起始物料的性質(zhì)及其對API質(zhì)量的影響建立合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。核苷亞磷酰胺和綴合物酰胺的質(zhì)量控制項目包括性狀、鑒別、有關(guān)物質(zhì)(包括異構(gòu)體)、殘留溶劑、31P純度、水分、含量等。預(yù)加載亞基的固相載體質(zhì)量控制項目包括物理性質(zhì)(粒度、膨脹度、堆密度等)、加載亞基的量、質(zhì)量(性狀、鑒別、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、水分)等。起始物料的質(zhì)量控制中最有難度的項目是有關(guān)物質(zhì)，應(yīng)對起始物料的雜質(zhì)譜分布進(jìn)行分析，了解雜質(zhì)的來源、衍生、去除情況，評估各雜質(zhì)對API質(zhì)量的影響，從而設(shè)定合理的特定雜質(zhì)、單雜、總雜的限度。

在起始物料的雜質(zhì)研究中，歐盟審評報告及EPOC均提到了起始物料中的雜質(zhì)根據(jù)與主鏈樹脂的反應(yīng)性和被工藝清除的能力將其分為兩大類，關(guān)鍵雜質(zhì)和非關(guān)鍵雜質(zhì)：關(guān)鍵雜質(zhì)是指具有與起始物料相似的反應(yīng)基團(tuán)(通常指含有亞磷酰胺及DMT基團(tuán)的雜質(zhì)),能與樹脂鏈反應(yīng)并衍生至API生成全長雜質(zhì)，這類雜質(zhì)通常無法通過強(qiáng)陰離子色譜被清除；非關(guān)鍵雜質(zhì)是指不與樹脂鏈反應(yīng)或即使反應(yīng)也易被清除，最終不影響成品純度。

起始物料的雜質(zhì)譜與其合成工藝相關(guān)，常見類型起始物料的合成工藝及關(guān)鍵、非關(guān)鍵雜質(zhì)分析如下。

3.2.1 脫氧核苷亞磷酰胺(簡稱脫氧酰胺) 

固相合成通過樹脂的5′-OH與下一個核苷酸的磷酰胺反應(yīng)生成磷酸二酯鍵，因此脫氧核苷亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)式見圖2)需要保護(hù)5′-OH(通常用三苯甲基DMT保護(hù))、磷羥基(通常用氰乙基CE保護(hù))、堿基上的伯氨(通常用酰基保護(hù))。

脫氧酰胺以發(fā)酵來源的天然脫氧核苷為起始物料(合成路線示例見圖3),先對堿基上的伯氨基進(jìn)行保護(hù)(由于胸腺嘧啶無伯氨基無需進(jìn)行保護(hù)),然后5′-OH經(jīng)DMT保護(hù)，再與磷試劑制備得到。

脫氧酰胺的合成過程雖然不會產(chǎn)生新的手性碳，但會產(chǎn)生手性磷中心，導(dǎo)致脫氧酰胺是一對非對映異構(gòu)體的混合物(在31P-NMR中為雙峰),EPOC指出起始物料中磷的絕對構(gòu)型不會影響API中非對映異構(gòu)體的分布。API中非對映異構(gòu)體的分布由偶聯(lián)反應(yīng)中的其他因素決定，可能機(jī)制為偶聯(lián)反應(yīng)中，手性磷被四氮唑活化時會迅速發(fā)生消旋，后續(xù)硫代反應(yīng)的立體選擇性受磷周圍手性基團(tuán)的影響，最終硫代磷酸酯雖然會存在過剩的磷異構(gòu)體比例，但通常在40∶60～60∶40之間;美國FDA也曾指出異構(gòu)體的比例受活化劑影響，不受起始物料構(gòu)型影響。因此EPOC指出無需控制起始物料中的磷異構(gòu)體比例。

脫氧酰胺中常見雜質(zhì)見表3,關(guān)鍵雜質(zhì)(同時含有磷酰胺基團(tuán)和DMT保護(hù)基團(tuán))為3′和5′-OH保護(hù)基相反的雜質(zhì)以及堿基未被保護(hù)的雜質(zhì)，可以通過嚴(yán)格的脫氧酰胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。脫氧酰胺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于控制關(guān)鍵雜質(zhì)和整體純度，可以采用HPLC法以及31P NMR法檢測雜質(zhì)和純度水平。

3.2.2  2′修飾的核苷亞磷酰胺(簡稱2′修飾酰胺)   

對于2′修飾(-OMe、-F、-OMOE)的核苷亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)見圖4)

以天然核糖核苷為起始物料，可通過對2′OH進(jìn)行修飾(修飾后的2′位為惰性反應(yīng)位點，不再參與反應(yīng)),后續(xù)的上DMT保護(hù)基及合成亞磷酰胺步驟與前述脫氧核苷相同。常見的2′-OMOE核苷亞磷酰胺的合成路線見圖5。

2′修飾酰胺中關(guān)鍵雜質(zhì)見表4。關(guān)鍵雜質(zhì)(同時含有磷酰胺基團(tuán)和DMT保護(hù)基團(tuán))除了與脫氧酰胺類似的3′和5′-OH保護(hù)基相反的雜質(zhì)和堿基未被保護(hù)的雜質(zhì)外，還包括2′-O烷基修飾的雜質(zhì)、2′和5′-OH保護(hù)基相反的雜質(zhì)，可以通過嚴(yán)格的脫氧酰胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。脫氧酰胺的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)側(cè)重于控制關(guān)鍵雜質(zhì)和整體純度，可以采用HPLC法(HPLC-UV,HPLC-MS)以及31P NMR來檢測雜質(zhì)和純度水平。

3.2.3 其他復(fù)雜的酰胺

脫氧酰胺和2′修飾酰胺的質(zhì)量控制要點亦適用于更復(fù)雜的酰胺類型，如2′,4′橋環(huán)核苷亞磷酰胺(LNAs)、磷酸嗎啉寡核苷酸(PMOs),結(jié)構(gòu)見圖6。

這類更復(fù)雜酰胺的供應(yīng)鏈可能不如前面所述的脫氧酰胺和2′修飾酰胺完善，而且合成路線更多樣，應(yīng)通過具體合成路線具體分析潛在的關(guān)鍵雜質(zhì)。有文獻(xiàn)提到，LNAs的關(guān)鍵雜質(zhì)包括橋環(huán)上甲基的異構(gòu)體以及脫甲基雜質(zhì)。

3.2.4 綴合物

綴合物包括小分子的膽固醇(cholesterol)、生育酚(tocopherol)、茴香胺(anisamide)、葉酸(folic acid)、多肽(peptides)、茴香酰胺(anandamide)、GalNAc、聚乙二醇醚(PEG)和大分子的抗體、適配體等。小分子綴合物通過適當(dāng)?shù)倪B接子與寡核苷酸共價連接。

GalNAc能通過與積木蛋白受體(ASGR)結(jié)合，將化學(xué)修飾的寡核苷酸靶向遞送至肝細(xì)胞。盡管GalNAc綴合物的化學(xué)修飾可以采取多種形式，但它們保留了共同的特征，即幾個GalNAc部分(通常為3個，形成三觸角結(jié)構(gòu))通過接頭連接到寡核苷酸。GalNAc可在固相合成最后的5′-端引入，也可通過預(yù)加載GalNAc的固相載體在3′-端引入。

具有雙賴氨酸部分的典型GalNAc綴合物結(jié)構(gòu)見圖7。通過天然糖和氨基酸反應(yīng)制備得到單一立體異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，其存在的潛在雜質(zhì)包括乳糖胺脫乙酰基雜質(zhì)等。目前，GalNAc綴合物在商業(yè)環(huán)境中的應(yīng)用是一個非常不成熟的領(lǐng)域，應(yīng)根據(jù)綴合物的合成工藝及結(jié)構(gòu)特點進(jìn)行工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的分析。

3.2.5 固相載體和預(yù)加載亞基的樹脂

固相載體雖然不是API的組成部分，但是其良好的質(zhì)量控制有利于API合成工藝的穩(wěn)健性，其關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括：性狀、鑒別(IR)、DMT含量(紫外法)、雜質(zhì)(HPLC法)。

雖然酰胺偶聯(lián)的產(chǎn)率通常非常高，由于空間位阻或者樹脂連接子上仲醇的反應(yīng)性較低導(dǎo)致第一個亞基的偶聯(lián)可能較困難，可以采用預(yù)加載一個亞基的樹脂進(jìn)行API的制備[已上市藥物(如inclisiran, givosiran等)采用預(yù)加載GalNAc的固相載體]。預(yù)加載亞基的固相載體質(zhì)量控制項目包括物理性質(zhì)(粒度、膨脹度、堆密度等)、加載亞基的量、質(zhì)量(性狀、鑒別、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、水分)等。由于樹脂的質(zhì)量表征方法有限，在論證預(yù)加載亞基的樹脂作為起始物料時，還應(yīng)注意從分析方法能否充分控制關(guān)鍵質(zhì)量屬性(尤其是對關(guān)鍵雜質(zhì)的控制)的角度論證其作為起始物料的必要性和合理性。

4、結(jié)語

由于寡核苷酸藥物制造工藝的復(fù)雜性以及API中存在的寡核苷酸類雜質(zhì)譜的復(fù)雜性，雜質(zhì)研究、表征和控制的挑戰(zhàn)性及局限性，要保證API批間質(zhì)量的一致性應(yīng)遵循從源頭控制的理念和良好的GMP生產(chǎn)，嚴(yán)格控制起始物料的質(zhì)量，在申報注冊時應(yīng)參照ICH Q11對起始物料選擇的合理性進(jìn)行論證。相比傳統(tǒng)小分子藥物，寡核苷酸藥物對起始物料的質(zhì)量要求更為嚴(yán)苛，因此應(yīng)選擇那些能持續(xù)提供良好質(zhì)量起始物料的供應(yīng)商，而且在變更供應(yīng)商時應(yīng)更為慎重。