前言
抗體-寡核苷酸偶聯藥物（AOCs）是一類由單克隆抗體和寡核苷酸（ONs）組成的新型合成生物偶聯物，其在現代生物技術的應用中引起了相當大的關注。AOC已被用于開發免疫測定方法，能夠檢測具有高特異性和敏感性的廣泛生物標志物。這些測定包括免疫PCR和鄰近連接分析（PLA），它們依賴于抗體的靶標識別特性和核酸的擴增特性。最近，還開發了幾種技術來利用AOC作為超分辨率成像劑，從而提高細胞成像的分辨率和對比度。
除了生物分析外，AOCs還因其通過表面受體介導的內吞作用將包括siRNA、反義RNA和CpG在內的遺傳治療有效載荷遞送到靶細胞中的潛力而受到極大關注。近年來，生物制藥公司將大量注意力和資源集中在開發基于AOC技術的先進藥物上。如Avidity、Dyne、Tallac、Denali和Gennao Bio，正在開發各種肌肉疾病的治療方法，如1型肌強直性營養不良（DM1）、杜氏肌營養不良以及癌癥和中樞神經系統疾病。Avidity的AOC 1001是第一個進入臨床試驗的AOC，以siRNA有效載荷靶向轉鐵蛋白受體1（TfR1），用于治療DM1。
盡管AOC在臨床上取得了成功，但高保真偶聯技術的發展是發現AOC先導化合物的關鍵部分。在過去的十年里，能夠精確控制AOC位點特異性和化學計量的化學和生物學方法不斷進步。這些技術得以確保抗體和寡核苷酸之間的牢固且精確的連接。此外，可及性、偶聯物穩定性和生產效率等參數在決定臨床候選藥物的成功潛力方面也發揮著至關重要的作用。
無連接子偶聯方法
在無連接子偶聯技術中，不需要雙特異性連接子作為將靶抗體連接到寡核苷酸上的粘合劑。通常，這種方法涉及對靶抗體結構的工程設計，以提供用于有效載荷ONs順序偶聯的特定生化處理。
氨基酸偶聯
無連接子偶聯的最常見方法包括用特定的天然或非天然氨基酸工程化靶抗體。通過引入特定的氨基酸，可以精確控制有效載荷ONs的數量和位置，半胱氨酸和谷氨酰胺是用于位點特異性偶聯的兩種常用氨基酸。
Cuellar et?等人報道了使用基于半胱氨酸的ThioMab技術將ONs共價偶聯到還原的抗體上，從而促進siRNA的遞送。還有人開發了一種谷氨酰胺介導的偶聯方法，利用微生物轉谷氨酰胺酶（mTG）將賴氨酸疊氮化物轉移到靶抗體上，通過無銅點擊化學偶聯含有二苯并環辛烯（DBCO）的siRNA，寡核苷酸-抗體比率為2。
為了克服天然氨基酸的缺點，另一種位點特異性偶聯方法是將含有反應性基團的非天然氨基酸（如疊氮基、乙酰基）引入靶抗體中。例如，在K169和S202，將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）引入曲妥珠單抗的Fab片段中，使其與羥胺修飾的單鏈DNA發生肟化反應，形成AOC，然后用于檢測Her2+細胞。與天然氨基酸偶聯相比，非天然氨基酸偶聯更穩定、更有效，然而，抗體工程也相對繁瑣。此外，這些非天然氨基酸是否會在人類中引起免疫原性仍不確定。
聚糖偶聯
由于IgG在Fc區的CH2或CH3區的N297處攜帶兩條N-聚糖鏈，遠離抗原結合區，確定連接的有效載荷ON的數量和位置相對簡單。例如，具有聚糖轉移活性的ENGase突變體（Endo-S，Endo-S2）可以產生具有同質聚糖結構的抗體。這種同質聚糖結構包含如疊氮化物和生物素的官能團，可以實現高效合成同質AOCs，并精確控制藥物抗體比例在2至12之間。
盡管聚糖結構的高度可變性可能對有效載荷的偶聯產生挑戰，但糖工程是一種有吸引力的天然抗體功能化生物偶聯技術。然而，工程抗體生產過程相對復雜，與其他AOC制備過程相比，不能保證高生產率。
肽偶聯
位點特異性偶聯可以通過將ON有效載荷偶聯到抗體末端的短肽標簽來實現，如谷氨酰胺標簽（LLQG）、Sortase A識別基序（LPETG）和SMARTag®（LCxPxR）。
轉谷氨酰胺酶能夠在LLQG的谷氨酰胺側鏈與其伯胺之間形成共價鍵；分選酶a介導的轉運可以將五甘氨酸修飾的藥物有效載荷轉移到LPETG基序上。另一種創新的化學酶方法是SMARTag®技術平臺：利用這項技術，甲酰基甘氨酸生成酶（FGE）可以將FGE識別基序（LCxPxR）中的半胱氨酸轉化為甲酰基甘氨酸（fGly），抗體就可以通過醛特異性化學轉化進行化學修飾，從而產生均勻穩定的偶聯物。
連接子介導的偶聯方法
盡管無連接子偶聯方法比較穩健，但它仍然需要對靶抗體進行工程化或修飾，這可能會影響處理某些類型天然抗體時的性能。如果可以引入連接分子來交聯靶抗體和ON有效載荷，而不是簡單地修飾抗體，則可以直接從天然IgG制備精確的AOC，而不需要額外的工程。Fc結合肽（FcBPs）是用于抗體識別的最廣泛使用的基序。這些肽能夠特異性識別IgG的Fc片段。
結合誘導的交聯
為了促進抗體和寡核苷酸之間的誘導交聯，已經開發了許多高反應性基序，如光交聯和化學交聯試劑，以在FcBP和靶抗體之間形成共價鍵。幾個可光活化的基團，包括二苯甲酮或馬來酰亞胺苯甲酰亞胺（MBP）、苯甲酰基苯甲酸、對苯甲酰基苯丙氨酸（BPA）、光亮氨酸（pLeu）和光甲硫氨酸（pMet），已成功地整合到FcBP中。光交聯的主要優點是其高特異性，這是由于激發的中間體的壽命短。這種方法的缺點是可能生成具有一個或兩個標簽的異質性AOC。
除了光交聯，化學交聯也可以連接氨基以產生共價AOC，如許多雙功能連接子，包括SMC、DSG和SIAB等。與光交聯相比，化學交聯更容易且具備更好的生物相容性。然而，它的反應效率相對較低，通常需要48?小時以實現高度結合。
結合誘導的替代
FcBP介導的交聯方法依賴于FcBP對抗體的高親和力。然而，引入大的異源FcBP可能會引起嚴重的免疫原性，且抗體的性質可能會受到影響。結合誘導的替代可以通過將官能團從FcBP轉移到抗體Fc片段中的特定位點（K248、N79等）來解決這個問題。FcBP用作引導劑，并且可以在抗體-寡核苷酸共價偶聯后被替換或釋放。
與無連接子的偶聯相比，連接子介導的偶聯可以更好地控制有效載荷的數量和位點特異性，而無需對抗體進行設計。在結合誘導的交聯中，FcBP得以保留，使該過程更加簡單有效。另一方面，結合誘導的替代避免了免疫原性和其他與FcBP相關的潛在問題，然而需要額外的制備步驟。
小結
鑒于ADC在臨床上取得的巨大成功，我們堅信AOCs作為一種基因治療遞送平臺具有非常光明的應用前景。在此之前，建立強有力的合成方法來產生精確的AOC將為此奠定堅實的基礎。因此，有必要對AOC的藥代動力學、免疫原性和療效進行全面深入的研究。相信AOCs將在未來十年為臨床應用提供光明的未來。
參考文獻：
1.Chemical Biology Approaches toward Precise Structure Control of IgG-Based Antibody-Oligonucleotide Conjugates. Chembiochem.2023 May 2;24(9):e202300077
