近日，山東百駿生物科技有限公司研發(fā)的“HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）”獲批上市，下面嘉峪檢測網(wǎng)與您一起了解一下HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）在臨床前研發(fā)階段做了哪些實(shí)驗(yàn)。

1、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的主要組成成分

產(chǎn)品主要組成成分見下表

2、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的預(yù)期用途

本產(chǎn)品用于體外定性檢測人外周靜脈全血樣本中 HLA-B*1301 等 位基因，不能區(qū)分 HLA-B*1301 基因純合型和雜合型。

本產(chǎn)品用于計(jì)劃服用氨苯砜治療麻風(fēng)病等疾病患者的用藥指導(dǎo)， 以避免氨苯砜綜合征不良反應(yīng)。 氨苯砜綜合征（DHS）是由臨床服用氨苯砜引起的嚴(yán)重副作用， 屬于重癥藥物不良反應(yīng)（ADR）的范疇。本病于 1949 年被首次報(bào)道， 1951年被 Allday 和 Barnes 命名為“D.A.D.P.S. syndrome” （氨苯砜綜 5 / 17 合征）。氨苯砜綜合征是一種非劑量依賴性的藥物超敏反應(yīng)綜合征 （DIHS），以突然發(fā)生的丘疹或剝脫性皮疹、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、單核 細(xì)胞增多以及內(nèi)臟損害等為臨床表現(xiàn)特點(diǎn)。臨床發(fā)病率為 0.5-3.6%， 死亡率高達(dá) 10%左右，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。

根據(jù) 2013 年發(fā)表于《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》期刊的文獻(xiàn)，HLAB*1301 作為氨苯砜超敏反應(yīng)綜合征（DHS）生物學(xué)標(biāo)記物，兩者的相 關(guān)性 OR 值為 20.53，P 值為 6.84×10−25，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 證實(shí) HLA-B*1301 與氨苯砜超敏反應(yīng)綜合征（DHS）發(fā)生緊密相關(guān)。 攜帶 HLA-B*1301 等位基因單個(gè)拷貝的個(gè)體（雜合攜帶者），服藥后發(fā) 生 DHS 的風(fēng)險(xiǎn)是不攜帶該等位基因個(gè)體的 33.6 倍；攜帶 HLA-B*1301 等位基因兩個(gè)拷貝的個(gè)體（純合攜帶者），服藥后發(fā)生 DHS 的風(fēng)險(xiǎn)是不攜帶該等位基因個(gè)體的 100.7 倍。

2021 年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)藥物不良反應(yīng)研究中心發(fā)表 的《Stevens-Johnson 綜合征/中毒性表皮壞死松解癥診療專家共識》中提出“HLA?B*1301 與氨苯砜、柳氮磺吡啶和復(fù)方磺胺甲噁唑誘發(fā)的藥物超敏反應(yīng)綜合征及 SJS/TEN 相關(guān)”，治療前檢測風(fēng)險(xiǎn) HLA 基因可預(yù)防 SJS/TEN 等重癥藥物不良反應(yīng)。

本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者個(gè)體化治療的選擇應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其它實(shí)驗(yàn)室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮， 不能以本試劑盒檢測結(jié)果作為臨床是否用藥的唯一依據(jù)。

3、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的檢驗(yàn)原理

本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 方法結(jié)合水解探針技術(shù)，對 HLA-B*1301 等位基因的兩個(gè)特定區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過擴(kuò)增曲線和 Ct 值來判斷該個(gè)體是否攜帶 HLA-B*1301 等位基因。

4、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的主要原材料研究

4.1 主要原材料的選擇

主要原材料包括：引物、探針、Taq 酶、dNTP 和陰陽性對照品等， 原材料均通過外購的方式獲得。其中引物和探針為開發(fā)人自行設(shè)計(jì)， 由合成公司采用 DNA 合成儀合成，經(jīng)純化后獲得。 通過功能性試驗(yàn)，篩選出最佳原材料和供應(yīng)商，制定了各主要原 材料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)檢驗(yàn)合格。

4.2 企業(yè)參考品設(shè)置

開發(fā)人設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品（RM（P001）），包括企業(yè)準(zhǔn)確度 參考品、企業(yè)特異性參考品、企業(yè)檢出限參考品、企業(yè)精密度參考品。 參考品采用臨床樣本制備而成。組成如下：

(1)陽性參考品 10 份，命名為企業(yè)準(zhǔn)確度參考品（P01~P10）。來源于經(jīng)檢測為 HLA-B*1301 純合型陽性及 HLA-B*1301 雜合型陽性的 樣本。

(2)陰性參考品 10 份，命名為企業(yè)特異性參考品（N01~N10）。來源于 經(jīng)檢測為 HLA-B*1301 陰性的樣本。

(3)精密度參考品 2 份，命名為企業(yè)精密度參考品（PC01~PC02）。為使用 HLA-B*1301 陰性的樣本作為基質(zhì)，將 HLA-B*1301 雜合型陽 性樣本稀釋至指定濃度后獲得。

(4)檢出限參考品 1 份，命名為企業(yè)檢出限參考品 LD01。為使用 HLA- 7 / 17 B*1301 陰性的樣本作為基質(zhì)，將 HLA-B*1301 雜合型陽性樣本稀 釋至指定濃度后獲得。

5、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的生產(chǎn)工藝和反應(yīng)體系研究

開發(fā)人對試劑盒反應(yīng)體系的研究包括靶標(biāo)序列的選擇、引物探針 濃度的確定、Taq 酶濃度的確定、dNTP Mix 濃度的確定、鎂離子濃度 的確定、陰/陽性對照品配方的確定等。對反應(yīng)條件的研究包括 PCR 退火溫度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)、擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間、PCR 反應(yīng)體積等。通過功能性實(shí)驗(yàn)，最終確定了最佳的反應(yīng)體系。

開發(fā)人根據(jù)試劑盒中試劑及組分的主要生產(chǎn)工藝的研究結(jié)果，確定了最佳的生產(chǎn)工藝。 

6、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的分析性能評估

該產(chǎn)品分析性能包括最低檢出限、精密度、準(zhǔn)確度、分析特異性 （交叉反應(yīng)、干擾試驗(yàn)）、核酸提取純化性能等。開發(fā)人開展了有效運(yùn)行的質(zhì)量管理體系下生產(chǎn)的 3 批產(chǎn)品在適用機(jī)型上的性能評估。

在最低檢出限研究中，開發(fā)人對將 HLA-B*1301 雜合基因稀釋至指定濃度的樣本進(jìn)行 20 次重復(fù)檢測，將至少 18 次檢測結(jié)果 CT 值≤ 30 且擴(kuò)增曲線為指數(shù)擴(kuò)增曲線的濃度作為 P1、P2 反應(yīng)體系的各自最低檢出限。另采用 3 批試劑進(jìn)行檢出限的驗(yàn)證，符合檢出限的性能要求，即最低檢出限為 5ng/μL。

在準(zhǔn)確度研究中，開發(fā)人選取了120例測序結(jié)果為 HLA-B*1301 陽性的樣本（其中 7 例純合型），采用 3 批試劑按說明書要求進(jìn)行檢 測，結(jié)果顯示陽性符合率 100%。

在精密度研究中，開發(fā)人針對 HLA-B*1301 陰性，HLA-B*1301 弱 陽性和 HLA-B*1301 中/強(qiáng)陽性三個(gè)水平的臨床樣本進(jìn)行了精密度評 8 / 17 價(jià)。分別評價(jià)了本產(chǎn)品的室內(nèi)和室間精密度，試驗(yàn)包含不同地點(diǎn)、操作者、儀器、運(yùn)行、批次等影響因素，結(jié)果顯示 CT 值 CV 值均符合性 能要求。分析特異性實(shí)驗(yàn)涵蓋交叉反應(yīng)研究及干擾因素研究。

交叉反應(yīng)評價(jià)中，開發(fā)人采用了自然人群中 HLA-B 區(qū)域攜帶頻率大于 4%的 15 種同源性序列進(jìn)行了交叉反應(yīng)研究，經(jīng)驗(yàn)證，所選擇 15 種同源序列樣本 與本產(chǎn)品均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

干擾研究實(shí)驗(yàn)中，咖啡采用在中低濃度的 HLA-B*1301 陽性及陰性樣本中加入干擾物質(zhì)的方法進(jìn)行驗(yàn)證，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，樣本中內(nèi)源性及藥源性干擾物質(zhì)不大于以下濃度時(shí)，試劑盒各項(xiàng)檢測結(jié)果符合要求：血紅素 300g/L、甘油三酯 6mmol/L、膽紅素 25 μmol/L、西替利嗪 500μg/L、潑尼松 90μg/L、克拉霉素 5μg/mL、伊曲康唑 4μg/mL、 阿維 A1000ng/mL、甲氨蝶呤 30 μmol/L、氨苯砜 4.82mg/L。

針對核酸提取純化步驟，開發(fā)人將試劑盒配套使用的核酸提取試劑與已上市質(zhì)量較好的提取試劑對全血樣本的 DNA 提取效率進(jìn)行平行比對，結(jié)果顯示核酸提取效率相當(dāng)，并對配套使用的核酸提取試劑提取后 DNA 的純度、濃度，精密度和抗干擾能力進(jìn)行了評估，性能均可滿足試劑盒檢驗(yàn)要求。

7、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的陽性判斷值的確定

使用ROC曲線法，采用HLA-B*1301雜合、純合陽性及陰性全血 樣本共計(jì)260例，利用考核試劑P1及P2反應(yīng)體系的檢測結(jié)果與樣本測 序結(jié)果進(jìn)行一致性比對分析。通過ROC曲線計(jì)算，最終確定檢測基因 片段P1及P2的陽性判斷值，均為Ct值≤30。 同時(shí)通過對上述260例樣本的內(nèi)參基因檢測結(jié)果進(jìn)行置信區(qū)間分 9 / 17 析，最終確定了內(nèi)參基因檢測結(jié)果的合格標(biāo)準(zhǔn)為Ct≤30。

8、HLA-B*1301 基因檢測試劑盒 （PCR-熒光探針法）的穩(wěn)定性研究

開發(fā)人對本產(chǎn)品的貨架效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、 樣本穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時(shí)間。

貨架效期穩(wěn)定性：采用3批試劑進(jìn)行研究，將試劑盒保存在-20±5℃ 條件下，分別于保存第0月、第3月、第6月、第9月、第11月、第12月、 第13月和第14月時(shí)取出試劑盒，對試劑盒的分析特異性、檢出限、測量準(zhǔn)確度、測量精密度四項(xiàng)性能指標(biāo)進(jìn)行檢測，確定產(chǎn)品在規(guī)定的儲(chǔ) 存條件下，可穩(wěn)定保存12個(gè)月。

開瓶穩(wěn)定性：將試劑盒于室溫下開瓶解凍后，再置于-20±5℃冷凍 條件下冷凍保存，參考實(shí)驗(yàn)室日常檢測條件下使用頻次及使用方式， 分別設(shè)置開瓶后第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天 分別對準(zhǔn)確度、分析特異性、測量精密度、檢出限指標(biāo)進(jìn)行評估，試劑盒在開瓶凍融后短期（7天內(nèi)）各性能均符合產(chǎn)品技術(shù)要求。同時(shí)， 開發(fā)人使用開瓶復(fù)融試劑完成長期（7個(gè)月）穩(wěn)定性研究，各性能均符 合產(chǎn)品技術(shù)要求。最終開瓶穩(wěn)定性結(jié)論為：在不同使用頻次下，試劑 盒性能均滿足要求，確定試劑盒開瓶凍融穩(wěn)定性有效期為6個(gè)月。

凍融穩(wěn)定性：試劑盒置于-20±5℃冷凍條件下冷凍保存，期間分次 取出，室溫放置至試劑盒內(nèi)組分完全融化后再重新放置 于-20±5℃冷 凍條件下冷凍保存。分別在凍融第1次，第2次，第3次，第4次、第5次、 第6次、第7次設(shè)取樣檢測時(shí)間點(diǎn)。對于不同凍融次數(shù)的試劑盒分別評 價(jià)分析特異性、檢出限、測量準(zhǔn)確度、測量精密度四項(xiàng)性能指標(biāo)，結(jié) 果均合格。試劑盒反復(fù)凍融穩(wěn)定性結(jié)論為不多于6次。

樣本穩(wěn)定性：開發(fā)人對全血樣本、提取后的DNA樣本進(jìn)行了樣本 穩(wěn)定性研究，研究結(jié)果表明：全血樣本短期（30天內(nèi)）可保存于-20±5℃， 反復(fù)凍融不宜超過2次，長期保存可置于-70℃以下，但不宜超過6個(gè)月， 反復(fù)凍融不宜超過3次；提取后樣本短期（30天內(nèi)）可保存于2～8℃， 長期（6個(gè)月內(nèi)）可保存于-20±5℃，反復(fù)凍融不宜超過3次。