1、抗體偶聯藥物(ADC, antibody-drug conjugate)的定義
抗體偶聯藥物(ADC)由抗體、細胞毒素和連接子組成（如圖1[1]），被認為是一種靶向治療各種類型腫瘤和癌癥的創新治療方法，能夠提高細胞毒素的治療參數，降低全身細胞毒性的可能性。ADC依靠高度靶向的腫瘤抗原識別和有效的內吞，在細胞表面識別并結合特定的腫瘤抗原，然后通過內吞作用進入腫瘤細胞，連接子或抗體在核內體或溶酶體內被消解，從而釋放細胞毒素殺傷腫瘤細胞[2]，同時，能夠起到延長細胞毒素的半衰期和降低其劑量限制性毒性的作用[3-5]。
圖1 ADC結構示意圖[1]
2、ADC的一般生物分析策略
ADC藥物的生物分析數據對于臨床前以及臨床研究的藥物代謝，毒性評價的起著重要的作用。由于ADC藥物結構的復雜性以及DAR值隨著藥物代謝不斷變化,通常需要對其幾種主要的存在形式進行定量分析，包括總抗體(DAR≥0)、偶聯抗體(DAR≥1)和非偶聯藥物[6-10]。基于配體結合分析(LBA，Ligand binding assay)和液相色譜-串聯質譜檢測(LC-MS/MS, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry)的生物分析方法已被用于分析各種ADC分析物[9,11]。其中LBA的分析方法通常用于檢測總抗體、偶聯抗體，LC-MS/MS的分析方法主要用于抗體結合的細胞毒素和非結合細胞毒素的分析，FDA已批準上市的藥物相關生物分析策略如表２所示。
表2 FDA批準上市的ADC藥物匯總
備注：ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, 酶聯免疫吸附法; ECLI: Electrochemiluminescence, 電化學發光法; LC-MS/MS: Liquid chromatography-tandem mass spectrometer, 液相色譜-串聯質譜;
ADC: 抗體偶聯物Tab: Total Antibody, 總抗體；Toxin: 細胞毒素;
對于總抗體和偶聯抗體的測定，最為廣泛使用的是ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, 酶聯免疫吸附法）和ECL（Electrochemiluminescence immunoassay , 電化學發光免疫測定），如圖2所示，對于總抗體的檢測，通常包被靶點抗原或抗CDR區（ADC抗體的互補決定區）單克隆抗體方式進行捕獲，通過抗ADC藥物的抗體部分進行檢測。對于偶聯抗體的檢測則有兩種方式，一種采用的與總抗體檢測相同的捕獲試劑，檢測試劑則采用的是抗細胞毒素的抗體；另一種采用的捕獲試劑為抗細胞毒性藥物的抗體，檢測試劑則是靶點抗原或抗CDR區單克隆抗體。游離細胞毒素的檢測是通過蛋白沉淀，液液萃取或固相萃取等小分子生物分析常用的前處理方法提取細胞毒素后直接進行LC-MS/MS的檢測。
圖2： ADC生物分析的常用策略
但當面臨特異性試劑制備周期過長或者試劑的特異性、親和力不滿足測試需求時，LC-MS/MS平臺則能夠提供一個速度快、成本低、一份樣品分析ADC全部檢測組分的優質解決方案。
3、LC-MS/MS：一份樣品完成ADC藥物的全組分分析
隨著LC-MS/MS方法檢測抗體等蛋白物質的技術逐漸成熟，也因其具有良好特異性，在ADC藥物的生物分析中除了將其應用于游離小分子細胞毒素和偶聯在抗體上的小分子細胞毒素的定量分析，還能在合適的免疫捕獲及酶解處理后，通過特征肽段對抗體部分進行定量分析。這就意味著，我們可以使用同一份樣品在LS-MS/MS平臺同時進行總抗體，偶聯抗體，以及偶聯藥物和非偶聯藥物的檢測。具體流程如圖3所示，一份樣品經過免疫捕獲之后，得到上清直接用于游離細胞毒素的檢測，捕獲下來的抗體部分，分成兩部分，分別進行處理，檢測偶聯抗體和總抗體。
圖3 ADC的LC-MS/MS平臺分析流
3.1 游離細胞毒素的藥物分析
游離細胞毒素的藥物分析有兩大注意事項，分別為靈敏度和穩定性。由于ADC的靶向性，以及臨床前安評試驗都用健康動物，缺少釋放毒素的腫瘤微環境，使得血漿中游離的毒素濃度極低，因此，定量下限需要做到皮克級。圖4為含10pg/mL MMAE大鼠血漿樣品的LC-MS/MS色譜圖。此外，由于最常用的蛋白沉淀方法處理樣本如果不夠干凈，可能會對檢測帶來干擾，可以通過液液萃取或是固相萃取的方法，使樣本前處理更加干凈，還能夠濃縮樣本，提高靈敏度。
為了得到樣本中真實的游離毒素濃度，連接抗體和毒素的連接子的血漿穩定性也需要考察。在穩定性考察實驗中，不僅要考察毒素本身在生物基質中的穩定性，還需考察ADC在樣品儲存過程中以及處理過程中是否釋放游離毒素。
圖4. 含10pg/mL MMAE的大鼠血漿樣品的LC-MS/MS色譜圖
3.2 偶聯抗體分析
分析偶聯抗體，需要針對不同的連接子選擇不同的解離條件。如果是采用酶來斷開毒素，酶的種類選擇，酶切的條件需進行細致的打磨，以得到盡可能高的酶切回收率。如圖5所示，通過這種方式，標準曲線可以在100倍左右的濃度范圍內呈現良好的線性回歸。對于可裂解的連接子，我們可以選用對應的酶，將其斷裂，然后直接測毒素的濃度即可。對于不可裂解的連接子，我們可以選擇Trypsin將其酶切，然后測毒素-連接子連接抗體的部分。
圖5.大鼠血漿中ADC藥物的標準曲線
3.3 總抗體藥物分析
和偶聯抗體相似，總抗體的測定需要經過捕獲、酶切等步驟，其中每一步在試劑選擇、反應時間、用量等方面都需要進行細致的探索，以達到理想的回收率。
3.4 DAR值測定
隨著ADC藥物在體內代謝，抗體上小分子藥物的載量會逐漸減少，對應著DAR的變化，而DAR的變化趨勢可以輔助闡釋ADC安全性和有效性。一個理想的ADC藥物應該是在血液循環中不釋放細胞毒素，到了靶向器官，再釋放，起到減小生物毒性，增加藥效的作用。由于不同DAR的ADC的絕對分子質量不同，高分辨率質譜四極桿-飛行時間分析器（HRMS-Q-TOF, High resolution mass spectrometry quadrupole - Time of Flight analyzer）因其高的分辨率，特異性和準確性的特性，在DAR的分析方面較普通質譜例如三重四極桿更有優勢，但其在靈敏度方面的表現乏善可陳，其定量下限往往只能做到ug/mL級別。
DAR值測定分為幾種情況，可直接檢測完整ADC分子的DAR，這種情況需要經過免疫捕獲，然后經過去糖基化等步驟，再進入高分辨質譜進行完整分子的測定，這樣可以直接反映出ADC分子上連接毒素的情況。而對于一些毒素只連接在輕鏈或者重鏈上，且連接情況比較簡單的情況下，也可以考慮用特定的試劑還原或者酶解，，然后測ADC的亞單位，這樣做的優勢是可以提高靈敏度。這部分的方案需根據具體的案例來特殊定制。
4、ADC抗體部分檢測的分析平臺對比
綜合來說， LBA和LC-MS/MS分析ADC藥物的總抗體和偶聯抗體，在特異性試劑的需求，特異性，靈敏度，通量等方面各有優勢。如表2所示，LBA平臺高度依賴于特異性試劑的質量和制備，那么其制備的質量和時間也影響著方法的特異性和開發周期，但是它的優勢在于靈敏度好，可以達到皮克級水平。
LC-MS/MS平臺分析抗體是通過特征肽段來進行分析的，不依賴于特異性試劑，因此方法開發的周期較LBA平臺更短，成本更低。這一優勢在不斷涌現的雙抗ADC藥物的生物分析中更加突出。同時，一份樣品可以進行ADC多種形態的測定，定量下限可以做到10ng/mL，能夠很好的滿足一般檢測需求。因此，可以根據檢測需求選擇分析平臺。當特異性試劑的制備周期過長，或特異性試劑的特異性不理想時，選擇LC-MS/MS平臺進行ADC藥物的檢測可以實現6周快速完成方法的開發和驗證以及樣品分析，同時因為不需要制備高成本的特異性試劑，方法和分析的費用也會有所降低。加上LC-MS/MS平臺可以做到同一份樣品得到所有組分的濃度結果這一獨特優勢，數據也具有更好的可比性。
當然，隨著質譜技術的不斷發展，LC-MS/MS分析的靈敏度在未來還會有更多的進步空間，來滿足更多的應用場景。
表2 LBA和LC-MS/MS平臺分析抗體組分的對比
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