有關物質系藥品中除主成分以外的雜質，它可能是原料藥合成過程中帶入的原料、中間體、試劑、分解物、副產物、聚合體、異構體，以及不同晶體、旋光異構的物質，也可能是制劑生產過程或在貯藏、運輸、使用過程中產生的降解產物等。由于有關物質的含量較少，所以選擇專屬性強、靈敏度高、重現性好的檢測方法至關重要。目前常用的方法有HPLC法和TLC法，后法已有討論。本研究主要闡述HPLC法的建立過程。

HPLC法檢測有關物質的方法有：

(1)雜質對照品法(適用于已知雜質)；

(2)主成分自身稀釋對照法(適用于一般雜質檢查，雜質成分少且尚不能取得其對照品，簡稱“自身對照法”)；

(3)歸一化法(現已不多用)。

前法為外標法、定量檢測；后兩法均為限量檢測。自身對照法又可分為加校正因子計算和不加校正因子計算。目前，國內多采用后法。

1、色譜條件的確定

專屬性是色譜條件建立的關鍵，通常是采用在被測物對照品(或供試品)中加入適量的雜質或輔料，以驗證所選色譜條件能否將各雜質與被測物分離檢出。應按1％(w/w)被測物濃度的各雜質量添加至被測物中，模擬被測物中可能存在雜質的狀態，即有少量(約1％)雜質存在時能否與被測物達到完全分離(分離度大于1.5)，以驗證系統適用性。

只有這樣才能較為客觀、科學地反映被測物的實際情況。而不應將被測物與各雜質配制成相同濃度的溶液，因為實際檢測中不可能存在這種情況，且該濃度也不易確定。在實際檢測時，由于被測物濃度較大，很易將相鄰雜質峰包含其中。

另外還需測定溶劑和輔料(檢測制劑時)是否有干擾。目前，美國藥典(USP)、英國藥典(BP)及許多進口產品的質量標準中，有關物質測定方法學的專屬性驗證均采用此法。還須說明的是：雜質與雜質峰間的分離度達1.2即可，而被測物與其相鄰雜質峰的分離度必須大于1.5。

2、檢測波長的選擇

有關物質檢測的研究對象是雜質，而非被測物。但測定則是通過各自的峰面積來表達，故波長的選擇必須考慮被測物和各雜質在檢測波長下的校正因子(f)是否相同。應分別制備相同濃度的被測物與各雜質溶液，經紫外掃描后以吸光度相近的波長為檢測波長。

在該檢測波長下，分別進樣測定，由各峰面積計算校正因子。若 f 為0.8～1.2，則表明被測物與各雜質的f相同，可消除 f 的影響。若f≤0.8或f ≥1.2，則應在計算時加入 f。目前通常以被測物的最大吸收波長為檢測波長、不加校正因子的計算方法，而未綜合考慮各雜質的 f 。

3、供試品溶液濃度的確定

供試品溶液濃度的確定也非常重要。雖然濃度越高越能反映被測物中雜質存在的情況，但若設定過高，會產生主峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況；若設定過低，則靈敏度不夠，無法檢測雜質及其含量變化。

最低檢出濃度的測定可分為信噪比法和直接評價法兩種。后法是目前較為科學的做法，即將儀器的靈敏度調至較適宜的值(僅對靈敏度可調節的儀器而言，目前市場上主流品牌的液相色譜儀均已設定了一個恒定、較為靈敏的值)，然后將被測物溶液不斷稀釋后進樣測定，直至被測物峰面積無法檢出為止，此時的濃度即為最低檢出濃度。

最大進樣量則是采用不斷增加被測物溶液濃度，直至峰嚴重拖尾、裂峰、柱超載和檢測器超載等情況出現。

根據最低檢出濃度，采用“上推法”來確定供試品溶液濃度：如一般設定雜質總量小于1.0％對照液，對照溶液的濃度至少應為最低檢出濃度的20～50倍，供試品溶液濃度則應是最低檢出濃度的2000～5000倍。

同時還應考慮儀器、色譜柱等因素對最低檢出濃度和最大進樣濃度的影響(即耐用性因素)，所以供試品溶液的濃度應在保證小于最大進樣量的情況下，適當設定得高些，以保證該濃度在任何試驗條件下，均有足夠的檢測靈敏度。

表1為最低檢出濃度、最大進樣量、供試品溶液和對照溶液間的比例關系(進樣量10μl，規定雜質限度1.0％)。

4、線性試驗

在穩定性考察中，如某雜質含量不斷增加，則說明被測物降解的途徑穩定、可循，則有必要對該雜質進行針對性地監控，即采用該雜質對照品(經確證結構后，由人工合成獲得)以外標法準確測定。此時，與含量測定相似，應進行線性試驗。

通常將雜質限度設定為該雜質的100％濃度，線性驗證范圍10％～150％(即相當于被測物測定濃度的1.5％～0.1％)。且精密度試驗也應符合要求，但RSD可根據實際情況，適當放寬至3.0％～5.0％。

5、加樣回收率試驗

回收率試驗采用在已知雜質含量的被測物中加入定量雜質的方法來評價。將各雜質以1％(w/w)的濃度加至被測物溶液中，以驗證所采用的色譜條件是否可分離檢測相應的各雜質以及與被測物中已存在的雜質是否累加，并觀測累加量的準確性。

6、強力破壞試驗

該項研究是為了揭示原料藥的內在穩定性，它也是研發中必不可少的一部分。這些試驗是在比加速試驗更劇烈的條件下進行，包含了藥品在銷售、運輸過程中可能遇到的各種復雜劇烈情況，以證明在所選色譜條件下，能否分別檢測在此劇烈條件下所產生的雜質。

強力破壞試驗條件有強光、高溫、高濕、強酸、強堿、氧化破壞等。破壞時不能過于劇烈，一般以產生20％～30％雜質的條件為宜(《化學藥物雜質研究技術指導原則》，國家食品藥品監督管理局藥品審評中心)。同時，還可采用二極管陣列檢測器(DAD)或質譜(MS)監測器進一步驗證主峰純度，觀察主峰中是否包含有被破壞產生的雜質峰。

當某雜質在穩定性試驗中不斷增加，且又主要是在某一強力破壞試驗條件下產生，則應在質量標準中的系統適用性試驗里，采用供試品溶液有針對性地進行強破壞處理，以驗證在該試驗狀態下所產生的雜質與被測物能否完全分離。

如奧美拉唑鈉易氧化破壞，因此注射用奧美拉唑鈉的國家藥品標準[WS1-(X-350)-2004Z]中規定，采用經3％過氧化氫溶液氧化破壞的奧美拉唑鈉溶液為系統適用性試驗溶液。

7、其他色譜參數的確定

流速的選擇：主峰保留時間應在10min以后，這樣主峰不易出現拖尾、堆積的現象。

柱溫的選擇：不應超過35℃，既可增強被測物與雜質的分離度，也可避免因溫度過高使主峰降解，導致測定誤差。

溶劑的選擇：由于有關物質測定的供試品溶液濃度高，應首先考慮被測物在溶劑中的穩定性一般選流動相作溶劑為宜，以排除溶劑峰的干擾。但由于有關物質的測定必須扣除溶劑峰，因此只要溶劑峰不干擾被測物質峰，即使不選用流動相作溶劑，也完全可以。

一些質量標準制訂時片面追求采用流動相作溶劑，有可能未將被測物全部溶解(由于有關物質測定多選用自身對照法，故未能發現)。在流動相溶解性不佳時，可采用甲醇或乙腈作溶劑以提高溶解性。

色譜圖記錄時間的設定：應能洗脫出有可能存在的全部雜質和經強力破壞試驗產生的雜質，并規定至主成分保留時間的幾倍為止。在測定制劑的有關物質時，個別輔料出峰滯后，此時應在質量標準中注明。

如鹽酸貝那普利片的國家藥品標準[YBH13652004]中，有關物質測定項下規定：記錄供試品溶液色譜圖至主成分峰保留時間的10倍，供試品溶液的色譜圖中如顯雜質峰，量取各雜質峰面積的和(扣除溶劑峰、溶劑峰前的輔料峰及主峰保留時間7倍后的輔料峰)。

積分參數的設定：色譜峰峰面積的大小主要由斜率和峰寬兩個積分參數決定。斜率越大，切線的傾斜角越大，峰面積越小；而峰寬一般無規律可循。此外還有一個非常重要的參數是最小峰面積。

該參數設定得越大，雜質峰越不容易被積分檢出，被測物雜質含量就易合格。關于最小峰面積的設定，目前國內還沒有一個定論，因此經常會在一些雜質總量稍多、雜質含量處于邊緣時，產生檢驗結論的分歧。

建議借鑒英國藥典(BP)的做法，即在所有采用HPLC法檢測有關物質的品種項下，均規定舍棄對照溶液主峰面積1/20以下的峰。也就是說0.05％以下的雜質峰可被認為與噪音相當、無必要積分。中國藥典2000年版二部中僅有頭孢克洛、頭孢呋辛鈉和硝苯地平3個品種項下有此規定；而2005年版二部中已增至25個品種，但均為抗生素品種。

8、討論

8.1 二極管陣列檢測器應用價值

DAD檢測器是對一個色譜峰的幾點進行紫外掃描，然后對所得圖譜進行比較以評價峰純度。但該檢測器功能有一定的局限性，只有當雜質紫外掃描圖譜與主成分紫外掃描圖譜有明顯不同時，才會有比較好的辨別功能。

8.2 質量標準中的系統適用性試驗

將與被測物峰最難分離的雜質以被測物濃度1％來驗證，從而確保即時試驗的專屬性。英國藥典和許多進口藥品質量標準均這樣擬定，而目前國內很少做到。

8.3 自身對照法和歸一化法的區別

將供試品溶液稀釋100倍后，所得的1％對照溶液主峰面積應為供試品溶液主峰面積的1/100。如相差甚遠，即說明稀釋100倍后主峰峰面積不呈線性，則必須采用自身對照法；如測定結果一致，則在穩定性試驗中便可采用歸一化法。但在質量標準中仍建議擬定為自身對照法。

對大部分藥品，以上兩法的測定結果均基本一致。其原因為：絕大部分藥品均是由碳、氫、氧、氮元素組成，該構成決定了在紫外檢測器上，物質的線性范圍均可達到1～106，只有少數物質，才會出現線性范圍很窄的現象。如唑來磷酸，其線性范圍就只有1～102，且須進行多次尋找才能找到適宜的濃度范圍。

8.4 HPLC法與TLC法檢測有關物質時的優缺點

HPLC法雖然優點眾多，但并不能完全替代TLC法。HPLC法可認為是在反相色譜上對被測物的檢測，TLC法則是在正相色譜上對被測物的檢測。目前國內有的質量研究中，盲目、片面采用HPLC法的做法是不可取的。

只有將兩法有機地結合、彼此間進行對比研究，取長補短，才能得到更全面、準確、清晰的雜質信息，所得結果才更客觀和科學。這也正是國外藥典對一些品種同時采用以上兩種方法進行有關物質檢測的合理性所在。