柱層析分離凈化的實驗技巧和方法

1　柱層析操作方法的選擇

　　目前 ,柱色譜分離的操作方式 ,主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離 3種模式。常壓分離是最簡單的分離模式方便、簡單 ,但是洗脫時間長。減壓分離盡管能節省填料的使用量 ,但是由于大量的空氣通過填料會使溶劑揮發 ,并且有時在柱子外面會有水汽凝結 ,以及有些易分解的化合物也難以得到 ,而且還必須同時使用水泵或真空泵抽氣。加壓分離可以加快淋洗劑的流動速度 ,縮短樣品的洗脫時間 ,是一種比較好的方法 ,與常壓柱類似 ,只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣 ,雙連球或者小氣泵等。

2　柱子規格的選擇

　　市場上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長了 ,相應的塔板數就高 ,分離就好。目前市場上的柱子 ,其徑高比一般在1: 5～10范圍 ,在實際使用時 ,填料量一般是樣品量的 30～40倍 ,具體的選擇要根據樣品的性質和含量進行具體分析。如果所需組分和雜質的分離度較大 ,就可以減少填料量 ,使用內徑相對較小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm內徑的柱子。

3　裝柱

　　柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種 ,濕法省事 ,一般用淋洗劑溶解樣品 ,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等 ,但溶劑越少越好 ,不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑 ,否則會被淋洗劑帶到淋洗液中 ,可以采用聚四氟乙烯材料的閥門。干法和濕法裝柱沒什么實質性差別,只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該有適度的緊密(太密了淋洗劑流速太慢 ) ,并且一定要均勻 ,不然樣品就會從一側斜著流動。同時柱中不能有大氣泡 ,大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響 ,因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開裂 ,開裂會影響分離效果 ,甚至報廢。

4　溶劑的選擇

      極性小的用乙酸乙酯：石油醚系統；極性較大的用甲醇：氯仿系統；極性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系統；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

　　選擇一個合適的溶劑系統是柱層析分離的關鍵。在選用柱層析洗脫劑時首先要考慮三個方面的因素:溶解性 ( Solubil2ity)、親合性 (Affinity)和分離度 (Res oluti on)。溶劑應選擇價廉、安全、環保的 ,可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價格較高 ,乙醚很易揮發 ,二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個放熱過程 ,易使柱子產生氣泡。其他的溶劑用的相對較少 ,要依不同需要選擇。另外值得一提的是 ,由于我們進行的是痕量分析 ,淋洗劑的純度必須關注 ,一般使用農藥殘留級或 HPLC級的 ,如果是分析純的必須進行精制。同時溶劑在過柱后最好回收使用 ,一方面環保 ,另一方面也能節省部分經費。

5　上樣

　　用少量的溶劑溶解樣品加樣 ,加完后將底端的活塞打開 ,待溶劑層下降至石英砂面時 ,再加少量的低極性溶劑 ,然后再打開活塞 ,如此兩三次 ,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑 ,一開始不要加壓 ,等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離 (2～4 cm) ,再加壓 ,這樣避免了溶劑 (如二氯甲烷等 )夾帶樣品快速下行。很多樣品在上柱前粘性較大 ,上樣后在柱上又會析出 ,這一般都是比較大量的樣品才會出現 ,是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差,能溶解的溶劑 (比如 DMF,DMSO等)又不能上柱 ,這樣就必須用干法上柱了。

6　淋洗液的收集和濃縮

　　用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強的話 ,就不容易流出 ,這時可以采用氧化鋁作固定相。柱層析后的淋洗液 ,由于使用了較多的溶劑 ,必須進行濃縮 ,如果待測物具有一定的揮發性 ,最好使用常壓揮發溶劑 ,否則易導致檢測結果偏低。

7  其他整理自網絡的經驗

裝柱子（添硅膠）時，有兩種方法：即濕法裝柱和干法裝柱，二者各有優劣。不論干法還是濕法，硅膠（固定相）的上表面一定要平整，并且硅膠（固定相）的高度一般為15cm左右，太短了可能分離效果不好，太長了也會由于擴散或拖尾導致分離效果不好。 

濕法裝柱是先把硅膠用適當的溶劑拌勻后，再填入柱子中，然后再加壓用淋洗劑"走柱子"，本法最大的優點是一般柱子裝的比較結實，沒有氣泡。 
干法裝柱則是直接往柱子里填入硅膠，然后再輕輕敲打柱子兩側，至硅膠界面不再下降為止，然后再填入硅膠至合適高度，最后再用油泵直接抽，這樣就會使得柱子裝的很結實。接著是用淋洗劑"走柱子"，一般淋洗劑是采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。通常上面加壓，下面再用油泵抽，這樣可以加快速度。干法裝柱較方便，但最大的缺陷在于"走柱子"時，由于溶劑和硅膠之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產生氣泡，這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴重時，整個柱子變花，樣品不可能平整地通過，當然也就談不上分離了。解決的辦法是：第一、硅膠一定要天結實；第二、一定要用較多的溶劑"走柱子"，一定要到柱子的下端不再發燙，恢復到室溫后再撤去壓力。 也有介紹在硅膠的最上層填上一小層石英砂，防止添加溶劑的時候，使得樣品層不再整齊。但我的感覺是如果小心上樣，添加溶劑，則沒有這個必要。

上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉移得到的溶液，沿著層析柱內壁均勻加入。然后用少量薌洗滌后，再加入。

濕法較方便，柱層析和TLC是有機化學工作者必須下苦功夫的兩項實驗技術。這兩項技術掌握與否，對于提高實驗的效率至關重要。常見的例子是：在柱層析時，由于層析柱中的硅膠填料裝得不均勻（沒有填嚴實），使得柱子在淋洗過程中就因為出現太多氣泡變花，導致分離效果不好。更常見的例子是：層析柱雖然裝得不錯，但是由于淋洗劑選擇不恰當，結果導致幾十毫克產品，用了幾百毫升淋洗劑都還沒有完全分離。分離同樣的東西，熟手可能只需要半個小時，而一個層析技術不過關的人可能半天都不能得到純品。由此可見，這兩項技術掌握與否，對于提高工作效率，減輕工作量，減少有機溶劑的使用，從而對身心健康和環境保護都有明顯的作用。 

柱層析關鍵在于柱子是否裝好和淋洗劑是否選擇恰當。而淋洗劑的選擇則是通過TLC確定。這里要指出的一點是：TLC的作用除了跟蹤反應進程，檢測試劑和原料純度外，一個重要的用途就是為柱層析選擇適當的淋洗劑。
上樣完畢后，接著即用淋洗劑淋洗。淋洗劑一般采用TLC分析得到的展開劑的比例再稀釋一倍后的溶劑。由于層析柱和薄板的不同，即使兩者使用的硅膠都相同，但是在把TLC分析得到的展開劑用在柱層析時，也顯得極性偏大，所以要稀釋一倍，但又不能稀釋太多，否則成了靠擴散作用來分離，效果也不會好。

接下來談TLC，需要切記的是： 
第一、某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。因此在尋找展開劑時，多嘗試幾種比例不同，成分不同的展開劑。展開劑的極性太小，點分不開，極性太大，也分不開.一般以目標產物的Rf值在0.3左右為最佳。
第二、點不能點得太濃,否則容易重疊,不易判斷,因為如果兩個點相近的話,一濃就變成一個點了。第三、板上點的展開的清晰程度和溶劑的極性和物質在該溶劑中的溶解性有關，只有兩者比較合適才能有一個交好的分離效果。 
選擇適當的展開劑是首要任務.一般常用溶劑按照極性從小到大的順序排列大概為：石油迷<己烷<苯<乙醚<THF<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇使用單一溶劑，往往不能達到很好的分離效果，往往使用混合溶劑通常使用一個高極性和低級性溶劑組成的混合溶劑，高極性的溶劑還有增加區分度的作用，常用的溶劑組合有：Petroleumether/Ethyl acetate, Petroleum ether/Acetone, Petroleum ether/Ether, Petroleumether/CH2Cl2, CH2Cl2/ethyl acetate, ethyl acetate/ MeOH, CHCl3/ ethyl acetate
展開劑的比例要靠嘗試.一般根據文獻中報道的該類化合物用什么樣的展開劑，就首先嘗試使用該類展開劑，然后不斷嘗試比例，直到找到一個分離效果好的展開劑。很多時候,展開劑的選擇要靠自己不斷變換展開劑的組成來達到最佳效果。我在實驗中，為了實現一個配體與其他雜質有效分離，曾經嘗試了所有的溶劑用來兩兩組合后，最后才找到petroleumether/THF這類不常見的混合溶劑。 
一般把兩種溶劑混合時,采用高極性/低極性的體積比為1/3的混合溶劑,如果有分開的跡象,再調整比例,達到最佳效果，如果沒有分開的跡象，最好是換溶劑。
對于在硅膠中這種酸性物質上易分解的物質，在展開劑里在利用TLC跟蹤反應時，在點板的時候往往是反應體系的混和溶液點一個點A，每種難揮發的原料各點一個點B,C, D等等，然后所有的原料和反應體系的混合溶劑再共同點一個混合點X，這些點在板上的位置如圖所示：A X B C D
這樣的好處是展開后可以清楚地看見每個點的位置，把A這個點展開后的各個層份的點與B,C,等原料比較，從而判斷原料消失沒有，點混合點X的目的在于，方便觀察，因為有時候，板展開后，各點的位置有些變形，或者由于邊緣效應等等，使得判斷不易。
利用TLC判斷物質的純度時，往往要和NMR相結合，因為某種樣品在這種展開劑中只顯示一個點，并不等于在別的展開劑中也只顯示一個點。但有趣的是，由于H NMR可鑒別的純度也就在95%左右，有時候H NMR現示較純的東西，一點板就會發現有幾個點。所以，兩者要結合使用。但是自己以前的樣品，則可以只通過點板來判斷純度。

硅膠柱層析慣用方法

1.稱量。200-300目硅膠，稱30-70倍于上樣量；如果極難分，也可以用100倍量的硅膠H。干硅膠的視密度在0.4左右，所以要稱40g硅膠，用燒杯量100ml也可以。
2.攪成勻漿。加入干硅膠體積一倍的溶劑用玻璃棒充分攪拌。如果洗脫劑是石油醚/乙酸乙酯/丙酮體系，就用石油醚拌；如果洗脫劑是氯仿/醇體系，就用氯仿拌。如果不能攪成勻漿，說明溶劑中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不與水配伍走分配色譜的話，必須預先用無水硫酸鈉久置干燥。氯仿用無水氯化鈣干燥，以除去1%的醇。如果樣品對酸敏感，不能用氯仿體系過柱。
3.裝柱。將柱底用棉花塞緊，不必用海沙，加入約1/3體積石油醚（氯仿），裝上蓄液球，打開柱下活塞，將勻漿一次傾入蓄液球內。隨著沉降，會有一些硅膠沾在蓄液球內，用石油醚（氯仿）將其沖入柱中。
4.壓實。沉降完成后，加入更多的石油醚，用雙聯球或氣泵加壓，直至流速恒定。柱床約被壓縮至9/10體積。無論走常壓柱或加壓柱，都應進行這一步，可使分離度提高很多，且可以避免過柱時由于柱床萎縮產生開裂。
5.上樣。干法濕法都可以。海沙是沒必要的。上樣后，加入一些洗脫劑，再將一團脫脂棉塞至接近硅膠表面。然后就可以放心地加入大量洗脫劑，而不會沖壞硅膠表面。
6.過柱和收集。柱層析實際上是在擴散和分離之間的權衡。太低的洗脫強度并不好，推薦用梯度洗脫。收集的例子：10mg上樣量，1g硅膠H，0.5ml收一餾分；1-2g上樣量，50g硅膠（200-300目），20-50ml收一餾分。
7.檢測。要更多地使用專用噴顯劑，如果僅用紫外燈，會損失較多產品，紫外的靈敏度一般比噴顯劑底1-2個數量級。
8.送譜。收集的產品旋干，在送譜前通常需要重結晶。如果樣品太少或為液體，可過一小凝膠柱，作為送譜前的最后純化手段。可除去氫譜1.5ppm左右所謂的“硅膠”峰。

注意事項
1.先根據TLC方法篩選好洗脫劑，使兩相鄰物質Rf值之差最大化
2.將柱子必須裝平整、均勻
3.考慮有限柱填料的吸附量

4.可考慮用梯度法分開并洗脫

快速柱色譜(Flash Column Chromatography)是一種快速而且（通常是）容易的分離復雜混合物的方法。柱色譜和薄層色譜的原理一樣，但它可以用于制備量物質的分離。因為我們是用壓縮空氣將溶劑推過柱子，故稱其為快速柱色譜。這不僅使分離效果更好，并且可縮短過柱時間。

制備和操作快速柱色譜：

1）確定干燥、不含溶劑的待分離混合物的重量。

2）用薄層色譜選取溶劑體系，使Rf的值處于0.2～0.3之間，但如果混合物復雜，這可能不現實。在比較復雜的情況下，可能需要借助梯度洗脫的方式，簡單地說，就是在純化洗脫的過程中不斷提高溶劑的極性，該技術在后面有更加詳盡的介紹。但是在薄層色譜分析中，你必需確定哪種溶劑體系將會使不同的點樣處于Rf在0.2～0.3的范圍之內。

3）確定用于樣品上柱的方法。你可有三種選擇：凈試樣法，溶液法或硅膠吸附法。

凈試樣法：如果樣品是非粘性油狀物，使用凈試樣法最為容易。你可以用一個長的滴管過濾器將液體引入柱中，然后用預先確定的溶劑體系進行淋洗，把所有組分洗入柱子中。

溶液法：凈試樣法有時可能會引起分離柱斷層。因此，對于液體和固體，更為普遍的方法是將樣品溶于溶劑中，然后將溶液加入分離柱。最理想的狀態是，混合物中所有組分在該溶劑體系（通常是戊烷或己烷）中的Rf為0。這在多數情況下是難以實現的，所以可選用那種只移動混合物中一個化合物的溶劑，或者你可以簡單地用所選擇的洗脫液。記住：后面兩種選擇對于難度較大的分離純化是有風險的。

硅膠吸附法：最后一個技術是將化合物沉積（吸附）到硅膠上，這對部分液體和所有固體都是有用的。注意：硅膠是酸性的，因此這一步驟將會破壞一些對酸敏感的化合物，它們通常需要在硅膠柱上再生。首先，在一圓底燒瓶中將混合物溶解在二氯甲烷中，加入硅膠（硅膠的質量大約是化合物質量的兩倍）。在旋轉蒸發儀上濃縮該溶液。注意：硅膠是非常細的粉末，很容易被吸入旋轉蒸發儀中。用玻璃毛塞住接頭或泵的保護裝置，以防止固體被吸入泵中。快速轉動亦可以避免這個問題的出現。當固體基本上干燥的時候（當多數固體從容器壁上脫落，說明固體已經干燥），從旋轉蒸發儀上卸下燒瓶，再用真空泵將溶劑抽盡（假設混合物中沒有易揮發性物質）。注意：用玻璃毛塞住真空泵接頭，否則你可能會發現硅膠（以及你的化合物）進入真空管并沉積在那里。一旦其完全干燥之后（固體中再沒有氣泡產生），從真空系統中取下燒瓶，用干凈的刮刀從壁上刮下固體。現在，你可以簡單地用粉末漏斗將這部份固體加到分離柱的頂端，然后用洗脫液淋洗（每次1.5mL）。【簡單了說就是硅膠拌樣時，防爆球口塞上棉花之類的東西，要不產品就會隨著硅基進水泵了】

4）確定合適的硅膠和化合物的比例。對于簡單的分離，通常要求兩者的比例為30~50：1（重量比）；但對比較困難的分離，需要的比例高達120：1。和一些經驗豐富的同事進行討論，將對你解決這個難題大有裨益。

5) 選取合適的分離柱。你所需用的硅膠量決定了分離柱的尺寸。是使用短而粗還是長而細的分離柱，迄今為止還沒有定論。我們認為短而粗的分離柱會有更好的分離效果，但是這個結論可能會被你以后的一些同事所質疑。當你首次開始實驗的時候，最好的選柱方法是向實驗室的同事了解：對給定的硅膠量，應選擇怎樣的分離柱！把結論記在筆記本上（這比測量分離柱的直徑方便很多）。

6) 選取合適的收集用試管。這也是一個向有經驗的同事們請教的好機會。但也有簡單的方法：將硅膠體積除以4，然后選取能裝下這個體積的試管就可以了。（200mL的硅膠對應于50mL的組分）

7) 一旦你選定了分離柱，你需要堵住活塞底端以避免硅膠的流失。通常，用一小團棉花或者玻璃毛加一根長棍或玻璃棒即可完成。【現在都是用磨砂底的硅膠柱，直接可以用了】

8) 在通風櫥中填充分離柱。考慮到要用大量揮發性溶劑，以及干燥硅膠對于健康的危害，不允許在通風櫥外進行柱的操作。檢查并確定柱子是否完全垂直，傾斜的柱子不利于分離。

9）關上活塞并且加上幾英寸高的洗脫液。

10) 用漏斗向分離柱中加入一些沙（干燥并且經過洗滌的）。目的是在塞堵物上鋪一薄層砂（不超過1cm），這樣可以避免硅膠落入收集瓶中。

11) 量取合適量的硅膠，最安全的方式是在通風櫥中量取。硅膠的密度大約是0.5 g/mL，因此可以直接用錐形瓶量取（100g＝200mL）。不要讓硅膠的體積超過燒瓶的1/3，因為我們還要在其中加入溶劑。

12) 在剛量取的硅膠中加入至少1.5倍體積的溶劑，將其制成漿狀，用力振蕩和強烈攪拌，使其充分混合，并且除去硅膠中的氣體（氣泡的存在將會使分離柱的效率大打折扣）。

13) 用粉末漏斗小心緩慢地將漿狀物移入分離柱中，注意不要破壞下面的沙層。注意在灌漿的過程中不時地停下來并且搖動漿體，以確保硅膠混合均勻。灌漿結束后，用洗脫液反復沖洗燒瓶幾次，并且將余下的溶劑硅膠混合物加入到分離柱中。

14) 用滴管和洗脫液將黏附在柱子頂部邊緣上的硅膠沖洗到溶劑層中。

15) 當所有的硅膠都被洗離柱壁，打開活塞，用壓縮空氣給柱加壓。柱內的硅膠將會壓縮到原來高度的一半左右。檢查以確保柱子的頂段平坦，如果不平，必需重新攪拌，然后沉降下來。在加壓下，加入過量的洗脫液，用鉛筆頭或橡皮塞輕輕地從敲打柱子，這將使硅膠顆粒填充得更加緊密。收集從柱子中流出的所有洗脫液，在加入化合物之后重復使用。

【注意：切記不要讓溶劑液面低于填充層。】

16）當柱子填充好以后，在硅膠的頂部加入沙子作為保護層。沙層需要填充的比較平整，厚度約在2cm左右。這在添加溶劑時起到保護柱子的作用——當溶劑加入過快時，如果沒有沙層的保護，溶劑可能會破壞填充硅膠的平整的表面（因此影響分離效果）。

17）在溶劑還沒有達到沙層之前，可以用壓縮空氣促使溶液層下降。

18）關閉活塞，將第一個試管放在柱子的出口下面。

19）小心地向分離柱中加入你的化合物——當添加液體時，確保是沿柱子的壁面加入，而不要直接滴加在柱的頂段。當沖洗含有混合物的燒瓶時，小心地一次性地將滿滿一滴管淋洗液加到分離柱中。然后打開活塞，當液體下降到填充物的頂段時關掉活塞。如此沖洗燒瓶三次。對沉積在硅膠上的混合物，還要再加2cm厚的保護沙層。

20）小心地在分離柱中加滿洗脫液。開始時可以用巴斯德球管加入溶劑。當加入了1cm高度的溶劑之后，最好打開活塞。繼續用滴管滴加溶劑，直到溶劑高于柱內的填充層幾個厘米。現在，可以通過一個粉末漏斗從錐形瓶中加入溶劑了——緩慢地讓它沿柱子壁加入。一定要有耐心，不要破壞柱內填充物的頂段。

21）當把洗脫液裝滿分離柱之后，你就可以開始“過柱”了。請記住快的流速將使分離更好地進行。調整空氣壓力使達到一個快的流速——但不能象消防籠頭那么快！保持壓力，在收集試管裝滿后換上一支新的試管。注意隨時向柱內補充溶劑。

22) 用TCL跟蹤柱子的分離進程。一邊收集樣品，一邊進行薄層色譜分析。這一點可能帶來一些忙亂，因此，你若要觀察色譜柱工作進展情況，則在一開始便可以減低氣壓（甚至完全去除）。

23）當操作梯度洗脫時，先用一種溶劑以保證具有較大Rf的化合物先從柱中被洗脫。當他們被安全地洗脫到收集燒瓶之后，便可以更換一種極性更大的溶劑繼續洗脫。注意：逐步提高溶劑的極性。過于急速的極性變換可能會使硅膠分裂——就像電影里可怕的地震場面一樣，柱內的填充層出現裂縫。這對你的分離將會非常不利！因此，以每100mL（或更多）溶劑中增加5％左右的極性，直至達到所希望的溶劑。然后，用該種洗脫液洗脫，直到目標化合物被洗脫出來。這個時候，你可以繼續更換洗脫液或者直接進行下一步。

24）當你確定所有目標化合物都已經從柱內被洗脫的時候，你就可以將每樣東西收拾起來了。首先，在分離柱的底端放置一個大燒瓶，然后用一個夾子切斷聯通分離柱的壓縮氣體的氣路。讓氣體將剩余的溶劑全部壓出柱子，然后干燥硅膠（從分離柱中移出硅膠比較困難，除非它是完全干燥的）。對于大的分離柱，這個過程差不多要耗費一個小時。

25）當分離柱在干燥之時，可開始將組分合并起來。用薄層色譜來確定哪個試管中含有所需的純樣品。將相似純度的組分合并放在大的圓底燒瓶中，并用旋轉蒸發儀進行濃縮。對于費時較長的柱子，可在柱分離過程中就合并流出的組分，以加速進程。

26）當完全除去溶劑后，就可以用NMR分析所得到的化合物了。