疏血通注射液是由水蛭和地龍制成的一種主要應(yīng)用于急性腦卒中的中藥注射劑，水蛭作為傳統(tǒng)中藥，具有破血通經(jīng)，逐瘀消癥的功效，臨床主治心腦血管疾病，包括急性心肌梗死、冠心病心絞痛、高血壓、腦出血、腦梗死等。

化學(xué)成分包括多肽、氨基酸、糖脂、碟啶、甾體及羧酸酯等化合物。地龍性寒、味咸，具有痛經(jīng)活絡(luò)、平肝息風(fēng)、清熱止驚的功效，研究報(bào)道地龍具有抗炎鎮(zhèn)痛、降脂、抑制血小板聚集等作用，化學(xué)成分主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、有機(jī)酸類、核苷等化合物。

短鏈脂肪酸（SCFAs）主要由腸道微生物代謝碳水化合物及蛋白質(zhì)形成，分為直鏈型[甲酸（FA）、乙酸（AA）、丙酸（PA）、丁酸（BA）、戊酸（VA）、己酸（HA）]與支鏈型[異丁酸（i-BA）、異戊酸（i-VA）]。

研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸與高血壓、高血脂、高血糖以及動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切。乙酸、丙酸、丁酸占人體中短鏈脂肪酸的95%以上，其具有明顯的活性，發(fā)揮重要的生理作用。

乙酸可通過短鏈脂肪酸受體FFAR2影響胰島素的分泌，丙酸具有抗炎、降脂、降低血糖的生理作用，丁酸可預(yù)防和抑制結(jié)腸癌，具有降血糖，降低膽固醇的作用。

研究發(fā)現(xiàn)疏血通注射液中含有大量的乙酸、丙酸、丁酸，因此有必要對疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸進(jìn)行檢測分析，為更好的控制疏血通注射液的質(zhì)量提供依據(jù)。

短鏈脂肪酸的分析方法較多，如氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）、毛細(xì)管電泳法（CE）等。

由于短鏈脂肪酸無紫外吸收且極易揮發(fā)，采用液相色譜法、毛細(xì)管電泳法串聯(lián)紫外檢測器測定時(shí)，樣品需進(jìn)行衍生化處理，操作過程繁瑣、耗時(shí)較長，與氣質(zhì)聯(lián)用法相比，使用氣相色譜法測定疏血通注射液中短鏈脂肪酸更加方便快捷。

采用氣相色譜法直接測定疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，無需衍生化，方法簡單、快速、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以準(zhǔn)確有效的分析疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量。

1、儀器與材料

GC-7890B氣相色譜儀；DB-FFAP毛細(xì)管柱（30.00m×0.25mm×0.25μm；）；XS205十萬分之一電子天平、AL204萬分之一電子天平；SB25-12DTN超聲波清洗器；XH-C振動(dòng)攪拌器。無水乙醇、濃鹽酸，超純水，對照品乙酸、丙酸、丁酸、2-乙基丁酸對照品。

2、方法

2.1 儀器與試劑

取乙酸、丙酸、丁酸對照品適量，精密稱定，分別置于10mL容量瓶中，加75%乙醇溶液定容，得到對照品儲(chǔ)備液，濃度分別為乙酸10.63mg/mL、丙酸3.192mg/mL、丁酸1.739mg/mL；

取2-乙基丁酸（2-eBA）對照品適量，精密稱定，置于100mL容量瓶中，以75%乙醇進(jìn)行定容，得濃度為628.7μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中備用。

分別取各對照品及內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，于10mL容量瓶中，加濃鹽酸100μL，以75%乙醇溶液定容，得到混合對照品溶液，濃度分別為乙酸1063.3μg/mL、丙酸240.0μg/mL、丁酸150.0μg/mL、2-乙基丁酸22.0μg/mL，并采用75%乙醇溶液（含1%鹽酸，2-乙基丁酸22.0μg/mL）1∶1逐級稀釋成一系列不同濃度的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

疏血通注射液樣品0.5mL置于離心管中，加1.5mL1.5%鹽酸乙醇溶液（含內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸29.5μg/mL），混勻，作為供試品溶液。水蛭、地龍粉末各0.5g置于10mL容量瓶中，加1%鹽酸乙醇溶液振搖，混勻，作為水蛭、地龍供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：DB-FFAP彈性石英毛細(xì)管柱；升溫程序：初始溫度50℃保持1min，以15℃/min升至120℃后保持6min，以7℃/min升至135℃保持1min，以100℃/min升至230℃后保持3min，進(jìn)樣口溫度：240℃，檢測器（FID）溫度：240℃，進(jìn)樣體積：3μL，分流比：10∶1，載氣：高純氮?dú)猓∟2），純度＞99.999%，流速1.0mL/min，尾吹氣：高純氮?dú)猓∟2），純度＞99.999%，流速25mL/min，氫氣流速30mL/min，空氣流速400mL/min。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

取“2.1”項(xiàng)下配制的一系列不同濃度的混合對照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。記錄色譜峰峰面積，以對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以各化合物峰面積（AST）與內(nèi)標(biāo)物峰面積（AIS）比值為縱坐標(biāo)，繪制各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，以信噪比S/N=3、S/N=10分別測定各化合物的檢測線和定量限。研究結(jié)果表明：乙酸、丙酸、丁酸在其線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9999，結(jié)果見表1。

按照“2.2”項(xiàng)下方法制備疏血通注射液供試品溶液，進(jìn)行日內(nèi)精密度、日間精密度（每日分別制備供試品溶液）、重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

日內(nèi)精密度RSD均小于2.4%，日間精密度RSD均小于0.66%，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明：疏血通注射液中乙酸含量211.70μg/mL，丙酸含量70.20μg/mL，丁酸含量25.60μg/mL，RSD均小于1.3%；各化合物在室溫條件下8h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD均小于2.3%，結(jié)果見表1。

在此基礎(chǔ)上，開展疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸含量測定的加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取疏血通注射液250μL，加入與樣品中乙酸、丙酸、丁酸量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?00μL（含乙酸106.4μg/mL、丙酸28.73μg/mL、丁酸24.35μg/mL），加入75%乙醇（含2%鹽酸，內(nèi)標(biāo)2-乙基丁酸35.20μg/mL）1.25mL，混勻，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件分析，乙酸、丙酸、丁酸平均加樣回收率為96.45%~103.70%，RSD均小于4.2%，結(jié)果見表2。

3.2 疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸的含量分析

采用建立的氣相色譜-氫焰離子化檢測器方法分析了疏血通注射液中乙酸、丙酸、丁酸，氣相色譜圖見圖1，結(jié)果顯示各酸分離良好，空白溶劑對其測定無干擾，原料藥水蛭、地龍樣品中均含有乙酸、丙酸、丁酸。

對36批疏血通注射液進(jìn)行含量測定，結(jié)果如表3所示：

疏血通注射液中乙酸含量為382.2~544.6μg/支，

丙酸含量為90.92~217.5μg/支；

丁酸含量為39.74~64.27μg/支；

乙酸、丙酸、丁酸的總含量為545.8~815.8μg/支。

3種短鏈脂肪酸中乙酸相對含量最高，丙酸次之，丁酸最低，各酸含量差異較大，3種酸總含量相對穩(wěn)定。

2015年版中國藥典一部附錄水蛭藥材為螞蟥、水蛭和柳葉螞蟥的干燥全體，地龍藥材為參環(huán)毛蚓、通俗環(huán)毛蚓、威廉環(huán)毛蚓和櫛盲環(huán)毛蚓除去內(nèi)臟的干燥體。

疏血通注射液由水蛭與地龍?zhí)崛　⒕贫桑瑢⑺巍⒌佚埶幉姆謩e置于0.9%氯化鈉溶液中浸漬24h絞碎研磨制成勻漿，勻漿液反復(fù)凍融、離心，分取上清液，超濾柱粗濾，濾液熱壓處理得水蛭、地龍?zhí)崛∫海崛∫夯靹虺瑸V，除菌，分裝即可。

疏血通注射液在制備過程中未引入含乙酸、丙酸、丁酸的試劑，而水蛭與地龍藥材的氣相分析結(jié)果顯示兩種藥材中均含有乙酸、丙酸、丁酸，因此推斷疏血通注射液中的乙酸、丙酸、丁酸源自水蛭和地龍。

綜上所述，本研究建立的疏血通注射液中乙酸，丙酸，丁酸的含量測定方法簡便、快速、靈敏，為更好的控制該注射液的質(zhì)量提供了依據(jù)，也為中藥注射液的質(zhì)量控制研究提供了參考。