中藥依靠其獨特的療效、較低的毒副作用在臨床上得到廣泛應用。但近年來, 部分中藥材不法商販使用合成染料將藥材染色后出售, 謀取暴利。這些合成染料大都具有一定的毒性, 在食品領域被禁止使用或嚴格控制用量, 染色行為對中藥的用藥安全構成了極大威脅。這些染色過的中藥材也可能作為原料用于中成藥的生產中, 污染中成藥。此外, 合成色素也可能用于制劑生產過程中, 以改善制劑外觀。如使用了沒有藥品輔料標準的色素, 或該生產工藝未向藥品監督管理部門申報, 上述行為就違反了藥品生產GMP規定。因此, 中成藥合成色素的測定方法也越來越受到關注。國家藥品監督管理部門對此高度重視, 審核并通過了多個中藥中合成染料的補充檢驗方法, 有力地打擊了中藥中使用合成染料的違法行為。

已報道的中藥中合成染料檢測方法主要有薄層色譜法、液相色譜法、液相色譜與質譜聯用、薄層色譜與質譜聯用以及離子遷移譜等, 其中液相色譜與質譜聯用是最常用的檢測方法, 質譜譜庫也已廣泛應用于染色物質篩查中。可能被染色的藥材主要有西紅花、紅花、烏梅、蒲黃、梔子、延胡索、石斛、黃連、黃芩、黃柏、紅花、丹參、朱砂、血竭等, 可能含有染色藥材的中成藥主要有少腹逐瘀丸、冠脈寧片等。

女金丸為婦科常用藥物, 由當歸、白芍、川芎等23味藥制成, 功能益氣養血、理氣活血、止痛, 臨床用于氣血兩虛、氣滯血瘀所致的月經不調等癥的治療。筆者實驗室得到8批疑似含有莧菜紅(amaranth)、亮藍(brilliant blue)、日落黃(sunset yellow)等合成染料的女金丸樣品, 對其中的染色情況進行了分析測定。

1 儀器與試藥

Agilent 1260-6410B液相色譜-質譜聯用系統, 配有二極管陣列檢測器及三重四級桿質譜檢測器, 安捷倫Mass Hunter化學工作站; Mettler XS105DU電子天平; KQ-300DA型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司; 超聲功率300 W; 頻率40 kHz); 莧菜紅(批號20121215)、日落黃(批號20130618)由天津市光復精細化工研究所提供; 亮藍由中國計量科學研究院提供[批號: GBW (E)100005a-08002]。乙腈為色譜純, 醋酸銨、乙醇、冰醋酸為分析純, 試驗用水為Milli-Q系統制備。

樣品共計8批次, 均標示為同一生產廠家生產。陰性樣品為市售另一廠家女金丸樣品。

2 方法與結果

2.1 制劑染色情況觀察

將丸劑切開, 觀察丸劑外層和內層的色差, 結果見圖 1。從圖 1可以看到, 該丸劑表層較內層顏色明顯偏深, 有可能存在外層色素染色情況。用棉花蘸取70%乙醇, 輕輕擦拭丸劑外側, 棉花被染為藍黑色, 見圖 2。提示丸劑表層含有色素。

圖 1 丸劑外層和內層的顏色差異

圖 2 棉花擦拭丸劑外側結果

2.2 色素種類確定

為確認制劑中是否含有合成色素以及所含色素種類, 參考本實驗室已建立的方法, 使用HPLC-DAD-MS對樣品進行測定。

2.2.1 對照品溶液制備

取莧菜紅、亮藍、日落黃對照品適量, 用甲醇溶解, 制成每1 mL中約含0.1 mg的混合對照品溶液, 用0.45 µm微孔濾膜濾過, 取續濾液, 即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取丸劑1包(水蜜丸, 5 g), 加70%乙醇溶液15 mL, 振搖5 min, 分取乙醇液蒸干, 加1.5 mL甲醇溶解, 再用0.45 µm微孔濾膜濾過, 取續濾液, 作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液制備

取陰性樣品丸劑5 g (水蜜丸), 同"2.2.2節下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 色譜條件

采用Phenomenon Luna C18(250 mm×4.6 mm, 5 µm)色譜柱, 以乙腈為流動相A, 0.05 mol·L-1醋酸銨(冰醋酸調pH 4.5)為流動相B, 線性梯度洗脫, 在30 min內, 流動相A的比例由2%升至70%;流速:1 mL·min-1;柱溫:25℃; DAD檢測器檢測波長范圍:400~700 nm, 各化合物檢測波長見表 1最大吸收波長; 進樣量10 µL。

表 1 各化合物色譜及質譜測定參數

2.4 質譜條件

流動相分流比約4:1;采用電噴霧離子源(electronic spray ionization, ESI), 二級質譜全掃描模式(product ion scan); 干燥氣溫度350℃; 干燥氣流速10 L·min-1;霧化氣壓力35 psi; 源電壓4 kV; 各化合物離子源、母離子、裂解電壓及碰撞能量等質譜參數見表 1。

2.5 樣品測定

取對照品及供試品溶液各10 µL, 分別注入高效液相色譜儀, 記錄色譜、可見光光譜及質譜圖, 結果見圖 3~5。從圖中可以看到, 在樣品中可檢測到與莧菜紅、日落黃和亮藍保留時間一致的色譜峰, 并且上述色譜峰的二級質譜譜圖與對照品基本一致。8個批次樣品均可檢出莧菜紅、日落黃和亮藍。

1.莧菜紅; 2.日落黃; 3.亮藍。圖 3 對照品(A)、樣品(B)和陰性樣品(C) HPLC-DAD色譜圖(400~700 nm)

圖 4 莧菜紅、日落黃及亮藍對照品(A)和樣品(B)可見光光譜圖(400~700 nm)

圖 5 莧菜紅、日落黃及亮藍對照品(A)和樣品(B)質譜譜圖

3 色素存在部位考察

為進一步確認合成色素的存在部位, 在刮取丸劑表層后, 采用HPLC-DAD分別對丸劑表層與內層樣品進行測定。

3.1 對照品溶液制備

制備方法同"2.2"節。

3.2 丸劑外層和內層供試品溶液制備

取8批次樣品各1丸, 刮取表層, 置2 mL塑料離心管中備用。刮除表層丸劑樣品用研缽研細后置于另一2 mL塑料離心管中。在各離心管中分別加入1.5 mL 70%乙醇溶液, 超聲提取30 min, 靜置使沉淀, 分取乙醇液用0.45 µm微孔濾膜濾過, 取續濾液, 作為丸劑外層和內層供試品溶液。

3.3 色譜條件

色譜條件同"2.3 "及" 2.4"節。

3.4 樣品測定

取對照品及供試品溶液各10 µL, 分別注入高效液相色譜儀, 記錄色譜圖, 結果見圖 6。從圖 6可以看到, 丸劑外層供試品溶液中可明顯檢出合成色素, 但內層供試品溶液中未檢出或僅可檢出微量的合成色素。8批次樣品均呈現相似結果。由此可以判斷合成色素主要存在于丸劑外層, 推斷可能在丸劑成型后加入, 以改善成品外觀性狀。

A.對照品；B.丸劑內層樣品（批號160102）；C.丸劑外層樣品（批號160102）；1.莧菜紅；2.日落黃；3.亮藍。圖 6 色素存在部位考察HPLC-DAD色譜圖（400~700nm）

4 討論

紅黃藍是構成不同顏色的三原色, 不同濃度的三原色可調配出豐富的顏色。莧菜紅、亮藍、日落黃就是較常用的紅色、藍色和黃色食用色素。食用色素大都為水溶性色素, 色牢度較蘇丹紅等化工染料差, 受潮時容易脫落, 在中藥非法染色中較少使用。在國家藥品監督管理局批準的烏梅(炙烏梅)藥品補充檢驗方法和檢驗項目中, 針對莧菜紅、亮藍、日落黃3種色素進行檢查, 方法正文中描述供試品溶液為墨綠色[17]。本次測定中, 丸劑外層供試品溶液呈藍黑色, 也是上述3種色素調配的結果。

莧菜紅、亮藍、日落黃等食用色素極性較大, 質譜較難裂解, 只有在濃度較大時方可得到其二級質譜譜圖。同時, 色素類成分的共軛體系較大, 在可見區均有較大吸收, 使用液相紫外可見波長檢測器測定的靈敏度較高。由于已使用質譜確認在制劑中含有合成色素, 在進行色素存在部位考察時, 我們僅使用了DAD檢測器進行檢測。

在刮取丸劑表層時, 有可能存在被染色的部分刮取不完全的情況。此外, 在丸劑外層染色時, 部分色素也可能滲入丸劑內層。丸劑內層供試品溶液可檢出少量色素, 可能由上述原因導致。

目前, 文獻報道的中藥染色, 其研究對象大都是染色中藥材或使用染色中藥材投料生產的中成藥。本研究發現某廠生產的女金丸中合成染料大都集中于丸劑外層, 分析原因可能是生產廠家為了保持各批次產品外觀顏色的一致, 使用染料對丸劑進行染色, 是生產過程中的染色。雖然在制劑中檢測到的合成色素屬于可食用色素, 毒性較小, 但仍具有一定毒性, 其在中成藥中的使用也應加以控制。此外, 該工藝如未上報藥品監管部門批準, 就屬于私自更改生產工藝的違法行為, 應嚴厲查處。在今后的中成藥染色物質檢測研究中也應考慮對制劑染色部位進行分析, 以推斷其染色原因, 便于監管。

何軼 , 張聿梅 , 魯靜 , 于建東 , 戴忠 , 馬雙成