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嘉峪檢測網 2019-03-06 16:00
葉綠素（Chlorophyll）是植物光合作用中的重要光合色素，可分為a、b、c、d四類。葉綠素不溶于水，而溶于有機溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等；葉綠素不很穩定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解；葉綠素a分子式為C55H72O5N4Mg，酸性條件下，葉綠素a分子很容易失去卟啉環中的鎂成為脫鎂葉綠素；葉綠素a存在于所有的浮游植物中，大約占有機干重的1%～2%。
葉綠素a本身對環境沒有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指標，可以通過測定水中浮游植物葉綠素a的含量，掌握水體的初級生產力情況和富營養化水平，在環境監測中，葉綠素a含量是評價水體富營養化的指標之一。
國外相關分析方法研究
ASTMD3731-87(2012)標準方法采用90%丙酮為提取試劑，玻璃纖維濾膜過濾水樣，研磨后4℃浸泡提取浮游植物的葉綠素。測定葉綠素的主要步驟如下:
（1）過濾：
抽濾前加入碳酸鎂懸濁液防止色素分解。負壓不能超過50kPa。
（2）葉綠素的提取：
先研磨，將濾膜放置于組織研磨器中，加入4-5ml 的90%丙酮溶液，500r/min 研磨3min。破碎濾膜上浮游植物藻類細胞。
然后浸泡提取：將破碎后的細胞提取液轉移至15ml 離心管中，用90%丙酮溶液沖洗研磨器及研磨杵一并轉入離心管，定容至10ml。混勻后4℃暗處浸泡提取。浸泡時間為15min 至24h。過程中要顛倒混勻數次。
最后離心澄清：1000g 離心20min 或過濾，將上清液轉移至旋塞玻璃小瓶中。
（3）測定方法：
分光光度法，三色方程測定664nm、647nm、630nm、750nm 吸光度計算葉綠素a、b、c 葉綠素含量。單色方程測定脫鎂葉綠素a 校正后的含量。
EPA446.0 采用90%丙酮為提取試劑，玻璃纖維濾膜過濾水樣，研磨后4℃浸泡提取藻類的葉綠素。主要測定步驟如下:
（1）抽濾：
采用玻璃纖維濾膜。將玻璃纖維濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，負壓不超過20Kpa。輕輕攪拌或顛倒混勻樣品，準確量取一定體積的水樣，緩慢減壓，水樣完全通過濾膜時結束抽濾。用鑷子將濾膜取出，帶有樣品一面向內對折，用濾紙吸干剩余水分。如不及時提取，應將濾膜放入培養皿中，外面包裹一層鋁箔，樣品濾膜-20℃暗處冷凍保存。
（2）研磨：
將濾膜剪成小塊放入組織研磨器管底，用大肚移液管加4ml 丙酮（90%），電動研磨500 轉/分提取1 分鐘，注意保持避光及低溫。將懸濁液轉移至15ml 帶旋帽的離心管中，再用6ml 丙酮沖洗研磨棒及玻璃管轉移至離心管中。定容至10ml。時間5min。然后冷暗處保存。用清水及丙酮清洗研磨器后再處理下一個樣品。最后做一個空白膜。
（3）低溫浸泡：
然后用力震蕩離心管，4℃浸泡2～24 小時，期間至少震蕩2 到3 次。充分提取。
（4）離心：
浸泡后提取后，675g 離心15 分鐘。
（5）測定方法：
分光光度法，于750、664、647、630nm 處測定吸光度值，三色方程計算葉綠素a、b、c1＋c2；單色方程測定脫鎂葉綠素校正的含量。90%丙酮調零，弱光中傾倒或用移液管將離心上清液轉移至玻璃比色皿中，750nm 吸光度值應＜0.005AU，否則應再次離心或通過玻璃纖維針式濾器。
標準的前處理操作同446.0，用熒光計進行測定。
標準的前處理操作同446.0，提取液離心后，過0.45μm針式濾器過濾，取50~200μl樣品進入高效液相色譜進行分析，檢測波長為440nm。
《ISO 10260-1992》、《英國標準協會BS ISO 10260：1992（2014）》、《日本JIS K0400-80-10：2000》。采用熱乙醇分光光度法測定葉綠素。主要步驟如下：
（1）提取方法：
可采用熱乙醇水浴法，準確量取20～25ml 乙醇（90%），浸泡濾膜，擰緊聚四氟乙烯帽的玻璃小瓶旋塞。輕微震蕩懸浮濾膜。將玻璃瓶放入75℃水浴鍋中，液面與樣品一致。水浴5min，輕微震蕩。取出室溫冷卻15min。濾膜過濾或者離心，取上清液分光光度測定。也可采用熱乙醇研磨法：加入75℃熱乙醇30～50ml。用棒式研磨器研磨3min。過玻璃纖維濾膜，轉移至100ml（或50）容量瓶中，定容。
（2）測定方法：
將前處理后的上清液轉移至比色皿中，并留有足夠體積用于酸化待測。90%乙醇調零，測定665nm及750nm 吸光度值。注意：665nm 吸光度值0.01～0.8 之間，所以應合適選擇過濾水樣體積、提取劑體積、比色皿量程。建議開始時選擇0.5L 水樣。用HCL（3mol/L）酸化提取液，用量每10mL 加0.01ml。震蕩，5～30min 后在665nm 處測定吸光度。國外相關標準分析方法見表3。
比較國外測定葉綠素的方法可知，EPA 447.0 高效液相色譜法能夠很精確的測定各種光合色素的含量，但是儀器昂貴，分析操作步驟繁瑣，EPA 445.0 熒光光度計也能夠精確的測定葉綠素a 的含量，特別是能夠測定葉綠素含量較低的樣品，但是分析過程中容易受其他色素或色素衍生物的干擾，因此這兩種方法難以作為常規的監測方法，而分光光度法由于操作簡單，成為最常用的葉綠素a 的測定方法。
國內相關分析方法研究
（1）抽濾：
在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜，倒入定量體積的水樣進行抽濾，抽濾時負壓不能超過50kPa。
（2）研磨：
水樣過濾后，取出帶有浮游植物的濾膜，在冰箱內低溫干燥6～8h后放入組織研磨器中，加入少量碳酸鎂粉末及2～3ml90%丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。
（3）離心：
用離心機（3000～4000r/min）離心10min。將上清液倒入5ml或10ml容量瓶中。再用2～3ml的90%丙酮，繼續研磨提取，離心10min。
（4）測定：
將上清液再轉入容量瓶中，重復1～2次，用90%的丙酮定容為5ml或10ml，搖勻。1cm比色皿，90%丙酮為參比溶液，750、663、645、630nm處測定吸光度值。
水利行業標準測定葉綠素的具體操作步驟如下：
（1）抽濾：
將玻璃纖維濾膜放置在連接有真空泵的抽濾器上，根據水樣中葉綠素的濃度準確量取一定體積的混勻水樣進行抽濾，負壓不超過20kPa，逐漸減壓，在水樣剛剛完全通過濾膜時結束抽濾，用鑷子小心將濾膜取出，將有樣品一面對折，用濾紙吸干剩余水分。如果樣品不能及時提取，應將吸干水分的濾膜放入培養皿中，外面包裹一層鋁箔，放入﹣20℃冰箱中保存。
（2）提取：
將過濾后的濾膜放入具塞玻璃離心管中，蓋緊塞帽。放入﹣40℃低溫冰箱中冷凍20min，取出放置于室溫下5min，此過程反復三次。向玻璃離心管中加入10ml 90%丙酮溶液，蓋緊塞帽劇烈搖振片刻，放置于4℃冰箱中，避光浸泡4～12h 備用，在浸泡過程中，應搖動2～3 次。
（3）離心：
將離心管放入離心機，以3500r/min 的速度離心15min。
（4）測定：
將離心后的上清液倒入1cm 比色皿中，以90%丙酮做參比，分別在750、664、647、630nm 波長處測定吸光度值。
（1） 過濾：
在過濾裝置上裝 還玻璃纖維濾膜，根據水體的營養狀態確定取樣體積，用量量筒量取一定量的混勻樣品，進行過濾，最后用少量蒸餾水沖洗慮器壁。
（2） 研磨：
將濾膜剪碎，放入研缽或勻漿器中，加入6~8ml90%丙酮，在500~1000r/min轉速下研磨1~3min，濾膜完全磨成糊狀后，將勻漿器中的樣品倒入離心管中，再用少許90%丙酮沖洗勻漿器2~3次，倒入離心管中，蓋上管塞，搖動后置于黑暗低溫處（冰箱）靜置，提取時間不少于8小時和不多于20小時。
（3） 離心：
將離心管放入離心機中，在3000~4000r/min轉速下離心10~15分鐘，將上清液移入具刻度離心管，再加少量90%丙酮于原抽提用的離心管中，再次懸浮沉淀物并離心，再將上清液合并，此操作應重復1~2次，直至沉淀物不含色素為止，最后將提取后的上清液定容到10ml。
（4） 測定：
測定665nm和750nm處的吸光度，用0.1N鹽酸酸化后再測定750和665 nm處的吸光度，代入公式計算葉綠素a和脫鎂葉綠素a的濃度。
將一定量水樣用玻璃纖維濾膜過濾，以90%丙酮為提取液研磨提取水中浮游植物的葉綠素，離心后測定其750nm、664nm、647nm、630nm 波長下的吸光度值，計算葉綠素a 的含量。
測定葉綠素的具體操作步驟如下：
（1） 過濾：
在過濾裝置上裝 還玻璃纖維濾膜，根據水體的營養狀態確定取樣體積，用量量筒量取一定量的混勻樣品，進行過濾，最后用少量蒸餾水沖洗慮器壁。
（2） 研磨：
將樣品濾膜放置于研磨裝置中，加入 3~4mL丙酮溶液，研磨至糊狀。補加3~4mL丙酮溶液，繼續研磨，并重復1~2次，保證充分研磨5min以上。將完全破碎后的細胞提取液轉移至玻璃刻度離心管中，用丙酮溶液沖洗研缽及研磨杵，一并轉移入離心管中，定容至10Ml。
（3） 浸泡提取：
將離心管中的研磨提取液充分震蕩混勻后，用鋁箔包好，放置于4攝氏度下避光浸泡提取2小時以上。
（4） 離心：
將離心管放入離心機，以3000~4000r/min的速度離心10min，然后用針式濾器過濾上清液得到葉綠素a的丙酮提取液待測。
（5） 空白試樣的配置：
用實驗用水按照與試樣的制備相同的步驟進行實驗室空白試樣的制備。
（6） 測定：
將試樣轉移至比色皿中，以丙酮溶液為參比溶液，于波長750nm、664nm、647nm、630nm處測吸光度。
國內外方法中的各種實驗條件總結如下：
（1）提取試劑：
除熱乙醇方法，國內外標準方法均采用90%丙酮作為提取試劑。EPA446.0 指出，90%丙酮溶液可以有效提取大部分藻類細胞中的葉綠素a，而且不產生其它衍生物。丙酮是國際上較為公認的提取葉綠素的試劑。
（2）濾膜：
除《水和廢水監測分析方法（第四版）》采用乙酸纖維濾膜外，均采用玻璃纖維濾膜。
（3）樣品保存方法：
樣品的保存條件各種方法略有不同，但水樣采集后均保證4℃冷藏保存，樣品濾膜可冷凍保存。而且葉綠素a 測定樣品濾膜冷凍后再研磨，可提高提取效率。如采樣后不立刻測定，-18℃下冰凍，再于室溫條件下融解，利用細胞內冰粒的形成和細胞液濃度的增高引起溶漲，使胞壁結構破碎引起葉綠素溶出。
（4）是否研磨及研磨后是否需要浸泡：
目前國內也有很多文獻報道了對上述葉綠素a提取方法的改進研究，如延長提取時間。水利部行業標準《葉綠素a的測定分光光度法》（SL88-2012）葉綠素測定的主要操作是低溫反復冷凍提取-避光冷藏浸泡-離心，在EPA的446.0的基礎上改進了提取方法。考慮到不同地區儀器設備的能力差異，-40℃的超低溫冰箱不是所有的環境監測部門均具備的儀器設備，所以將樣品濾膜的冷凍作為輔助的提取條件。
（5）計算公式及波長：
關于計算方法，主要有三色法和單色法，三色法主要考慮了葉綠素b 和葉綠素c 對測定的干擾，測定的是表觀葉綠素a 的含量（包括葉綠素a 與脫鎂葉綠素a 之和），單色法考慮脫鎂葉綠素a 的干擾.從方法的簡便性來說，三色法操作簡單，產生誤差幾率小，耗時比單色法短。
來源：實驗與分析
